黃詩穎, 譚景艾, 王鵬, 蔣寧飛, 賀浩華,, 邊建民,*

1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué), 作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 江西省水稻高水平工程研究中心, 南昌 330045；2.浙江省建德市種子管理站, 浙江 建德 311600

目前，土壤重金屬含量超標(biāo)已成為威脅作物生長發(fā)育及影響作物產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素之一。鎘(Cd)是一種致使土質(zhì)下降且生物毒性極強(qiáng)的重金屬[1]，水稻作為最主要的糧食作物之一，對(duì)Cd脅迫的耐受性較低。有關(guān)水稻在Cd脅迫下生長發(fā)育所受影響的研究，大多集中在Cd積累對(duì)于植株地上部分的影響，如影響光合效應(yīng)[2]、抑制蒸騰作用[3]、干擾植物的代謝進(jìn)程[3]、加速植株的衰老等[4]，即大多研究集中在生殖生長階段Cd脅迫對(duì)水稻植株的影響，但關(guān)于萌芽時(shí)期水稻對(duì)Cd脅迫耐受性的研究報(bào)道不多[5]。稻種萌芽后，根系與土壤接觸，是植物從土壤中吸收養(yǎng)分的重要介質(zhì)[6]，而幼芽生長成為植株的地上部分，Cd的存在可抑制幼苗酶類活性，生理作用受到抑制，導(dǎo)致幼葉與根系細(xì)胞組分的嚴(yán)重缺失，影響生長[7]。稻種萌芽期對(duì)環(huán)境脅迫極其敏感，是水稻營養(yǎng)生長階段的基礎(chǔ)，因此，研究水稻萌芽期的耐Cd能力，對(duì)于挖掘水稻耐Cd作用機(jī)理與遺傳特點(diǎn)具有重要意義[8]。

Cd脅迫下水稻植株表現(xiàn)的性狀多為數(shù)量性狀[9]，定位耐Cd脅迫相關(guān)數(shù)量性狀基因座(quantitative trait loci，QTLs) 對(duì)于進(jìn)行水稻Cd脅迫分子標(biāo)記輔助育種具有重要意義。目前，水稻Cd積累QTLs定位研究多集中在苗期和成熟期，如利用回交重組自交系群體(recombinant inbred lines，RIL)及關(guān)聯(lián)分析等方法定位了水稻種子萌發(fā)和幼苗生長的Cd積累相關(guān)QTLs[10-14]；林輝鋒等[15]以Lemont和Dular雜交建立重組自交系群體，利用水培液共檢測(cè)到9個(gè)苗期耐Cd QTLs，其中位于1號(hào)染色體上的qRAP-1a與根長相關(guān)，可以解釋9%的表型變異。此外，研究人員以不同遺傳群體及檢測(cè)方法定位到一系列Cd積累相關(guān)的QTLs，并進(jìn)行克隆，如利用鎘高積累品種Anjana Dhan和日本晴構(gòu)建定位群體，克隆得到水稻低鎘積累基因OsHMA3[16]；利用臺(tái)中1號(hào)和春江06 2種差異明顯的品種構(gòu)建雜交群體，克隆到1個(gè)調(diào)控水稻葉片Cd積累基因CAL1[17]。根據(jù)前人研究可知，水稻苗期Cd積累會(huì)影響植株葉綠素含量、葉長、根長、株高及干重等性狀[18]，但定位的鎘脅迫下控制水稻萌芽期根長、芽長的QTLs不多，水稻萌芽期種子的萌發(fā)狀況決定了植株后期的生長情況，最終影響產(chǎn)量，因此，研究水稻萌芽期種子Cd遺傳情況，定位萌芽期耐Cd脅迫的QTLs，對(duì)指導(dǎo)水稻耐Cd育種有重要作用[19]。

昌恢891是江西省主要的秈稻種質(zhì)資源[20]，02428是廣親和的粳稻品種[21]，二者Cd脅迫耐受能力存在差異，基于此，本研究利用水稻02428和昌恢891衍生的124個(gè)回交重組自交系(backcross recombinant inbred lines，BIL)群體[22]，研究鎘脅迫水稻萌芽期根長、芽長的生長情況，并對(duì)稻種萌芽期耐Cd脅迫的QTLs進(jìn)行定位，目的是初步解析水稻萌芽期Cd脅迫后根長、芽長遺傳機(jī)理，定位其中影響水稻萌芽期耐Cd脅迫的QTLs，以期為進(jìn)行耐Cd水稻新品種的選育提供理論參考和基因資源。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1植物材料 植物材料由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生理生態(tài)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。以粳稻品種02428為背景的BILs群體是利用02428與昌恢891雜交，通過與02428回交、自交，建立回交重組自交系群體。該群體包含124個(gè)家系[22]。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 恒溫培養(yǎng)箱(日本PHCbi公司)；移液槍(德國Eppendorf公司)；NaClO溶液(天津大茂化學(xué)試劑廠)。

1.2 遺傳圖譜的構(gòu)建

利用全基因組重測(cè)序技術(shù)對(duì)124個(gè)BILs家系進(jìn)行基因分型。操作步驟為：提取親本與BILs群體的基因組DNA；利用物理法斷裂DNA并構(gòu)建300 bp的文庫；通過華大基因MGISEQ-2000設(shè)備對(duì)文庫測(cè)序?；跍y(cè)序結(jié)果進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)標(biāo)記的篩選并進(jìn)行分類，然后將連續(xù)多個(gè)SNP標(biāo)記且具有相同的基因型概括為一個(gè)Bin標(biāo)記[22]，利用這些Bin標(biāo)記結(jié)合JoinMap 4.2軟件構(gòu)建BILs群體的高密度圖譜。

1.3 形態(tài)指標(biāo)考察

參考水稻生理實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[23]，隨機(jī)挑選健康飽滿的種子100粒，以1.5% NaClO溶液消毒30 min，而后以去離子水沖洗3次，再用蒸餾水浸泡24 h后，選擇露白的種子50粒于培養(yǎng)皿中進(jìn)行脅迫處理。加17 mg·L-1的CdCl2溶液進(jìn)行鎘脅迫處理(Cd)，以不加CdCl2溶液的處理作為對(duì)照組(CK)。培養(yǎng)7 d，其中，光照時(shí)間為14 h·d-1，黑暗時(shí)間為10 h·d-1，光照期間溫度為28 ℃，黑暗期間溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度為360 μmol·m-2·s-1。測(cè)量芽長、根長2項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)[24]。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值用于QTL定位。

1.4 QTL定位

利用 QTL IciMapping V4.2軟件，采用復(fù)合區(qū)間作圖法，對(duì) BIL 群體在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)控制芽長、根長QTLs。將LOD值2.5定為閾值，若標(biāo)記區(qū)間的LOD>2. 5，則認(rèn)為該區(qū)間LOD值最高處所對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)為該性狀的1個(gè)QTL[25-26]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有原始數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2010進(jìn)行分析；根長、芽長的數(shù)據(jù)利用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳圖譜的構(gòu)建

利用全基因組重測(cè)序技術(shù)對(duì)124個(gè)BILs家系進(jìn)行基因分型。與日本晴參考基因組相比，親本02428和昌恢891的SNP數(shù)分別為22 358和85 605。最終，在2個(gè)親本中共檢測(cè)到70 480個(gè)高質(zhì)量SNP，進(jìn)而對(duì)來自124個(gè)BIL群體的群基因組重新測(cè)序并利用產(chǎn)生的3 057個(gè)重組位點(diǎn)制作了連鎖圖譜。該圖譜的總遺傳距離為1 266.5 cM，12個(gè)水稻連鎖群的標(biāo)記數(shù)和標(biāo)記密度各不相同(圖1)。其中，8號(hào)染色體標(biāo)記密度最高(0.24 cM·標(biāo)記-1)。10號(hào)染色體標(biāo)記密度最低(0.54 cM·標(biāo)記-1)[22]。

圖1 BIL群體標(biāo)記密度分布圖Fig.1 The high density map of the BIL population

2.2 水稻BIL群體耐鎘脅迫分析

為分析BIL群體Cd耐受力，將水稻萌發(fā)種子于溶液培養(yǎng)7 d，表1和圖2為BIL群體芽長、根長在Cd脅迫與水溶液處理下表型數(shù)據(jù)及分布。將對(duì)照組與Cd溶液處理組比較可知，02428相對(duì)芽長減少了30.65%，相對(duì)根長減少了81.48%；昌恢891相對(duì)芽長減少了20.46%，相對(duì)根長減少了82.49%。水溶液條件下，BIL群體芽長、根長變幅分別為0.28 cm和3.31 cm，標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.53和1.82；Cd溶液條件下，BIL群體芽長、根長變幅分別為0.15 cm和0.40 cm，標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.38和0.63。根長和芽長在Cd脅迫與水溶液處理下均表現(xiàn)為正態(tài)分布，可以用于QTL定位分析。

2.3 差異分析

為分析根長、芽長受Cd脅迫的影響，圖3為第7天所測(cè)根長、芽長的數(shù)據(jù)結(jié)果。Cd脅迫與對(duì)照組下的根長、芽長差異顯著(P<0.01)，這說明在Cd脅迫下稻種的萌發(fā)生育受到顯著抑制；同時(shí)，比較根長、芽長的Cd脅迫與對(duì)照組的差值可知，根長的差值較大，這說明在稻種萌芽期，Cd脅迫對(duì)于根長的抑制較芽長更明顯。

表1 鎘脅迫及水溶液處理下根長、芽長表現(xiàn)Table 1 Root and bud length performance under cadmium stress and aqueous solution

圖2 BIL群體根長芽長頻率分布圖Fig.2 BIL population root growth and shoot length frequency distribution diagram

注：**表示根長、芽長的Cd脅迫與對(duì)照組的差異極顯著(P<0.01)。圖3 處理第7天根長、芽長差異分析Fig.3 Correlation analysis of root length and shoot length on the seventh day of treatment

2.4 QTL定位

利用IciMapping V4.2軟件，結(jié)合已經(jīng)構(gòu)建的連鎖圖譜，對(duì)在鎘脅迫與水溶液處理下控制根長、芽長的QTLs進(jìn)行分析，共檢測(cè)到7個(gè)QTLs(表2)，分別分布于第3、4、7、8、9染色體上，LOD值為2.70～5.21，貢獻(xiàn)率為6.45%～19.46%。

2.4.1根長QTL定位 鎘脅迫條件下，共檢測(cè)到1個(gè)控制根長的QTL，位于第7條染色體上，命名為qCdRL7，LOD值為5.21，貢獻(xiàn)率為19.46%，來自02428的等位基因，能增加水稻根長；水溶液條件下，檢測(cè)到1個(gè)控制根長的QTL，位于第4條染色體上，命名為qCKRL4，LOD值是2.85，加性效應(yīng)為0.83，貢獻(xiàn)率是10.89%，來自昌恢891的等位基因，能增加水稻根長(表2)。

2.4.2芽長QTL定位 鎘脅迫條件下，共檢測(cè)到4個(gè)控制芽長的QTLs，分別位于第3、8、8和9染色體上，命名為qCdBL3、qCdBL8.1、qCdBL8.2和qCdBL9，LOD值分別為4.48、2.96、2.85和3.77，貢獻(xiàn)率分別為10.87%、6.90%、6.45%和8.76%。其中，qCdBL3、qCdBL8.1和qCdBL8.2增效等位基因來自02428，qCdBL9增效等位基因來自昌恢891。水溶液對(duì)照處理下，共檢測(cè)到1個(gè)控制芽長的QTL，命名為qCKBL8，位于第8條染色體，LOD值是2.70，貢獻(xiàn)率是10.53%，增效等位基因來自02428。

表2 鎘脅迫及水溶液處理下控制根長、芽長響應(yīng)QTLTable 2 Response QTLs of root length and shoot length under cadmium stress and aqueous solution treatment

3 討論

前人研究表明，不同水稻品種耐Cd能力因基因型不同而存在差異[27]。研究顯示，在Cd脅迫下，粳稻02428芽長與根長均表現(xiàn)出更明顯的變幅，即萌發(fā)期Cd脅迫對(duì)粳稻02428抑制作用要明顯大于對(duì)秈稻昌恢891的抑制，表明萌發(fā)期秈稻、粳稻Cd耐受能力存在差異，證實(shí)水稻種子萌發(fā)期對(duì)Cd脅迫較為敏感[28]。本研究表明，Cd脅迫對(duì)秈稻昌恢891和粳稻02428萌發(fā)期芽長和根長均有顯著的抑制作用(P<0.01)，其中Cd對(duì)根長的抑制強(qiáng)于芽長，說明萌芽時(shí)期水稻不同部位受Cd抑制程度不同。

李煒星等[29]以秈稻品種昌恢121為輪回親本、粳稻品種越光為供體親本構(gòu)建的CSSL群體，以根長、苗長等6個(gè)性狀指數(shù)為耐Cd指標(biāo)，檢測(cè)到7個(gè)相關(guān)QTLs，其利用根長作為抗性指標(biāo)所定位到的位于第7號(hào)染色體RM1306處的qTRFW7與本研究定位到的qCdRL7位置接近，說明第7條染色體上存在控制水稻萌芽期根長發(fā)育的QTL位點(diǎn)；Xue等[30]以秈稻ZYQ8和粳稻JX17為親本構(gòu)建的DH群體，共定位到22個(gè)與幼苗期Cd耐性和積累相關(guān)的QTLs，其中以幼苗長度作為抗性指標(biāo)定位的qSH8與本研究所定位到的鎘脅迫芽長相關(guān)QTLqCdBL8.2接近，表明第8號(hào)染色體153～154區(qū)段可能在著控制水稻全生育植株高度基因(QTL)。本研究檢測(cè)到位于第3號(hào)和9號(hào)染色體上控制芽長的qCdBL3和qCdBL9，在之前的研究中未被檢測(cè)到，可能是與幼苗期鎘脅迫相關(guān)的新QTLs。

本研究以Cd脅迫下根長、芽長指數(shù)作為指標(biāo)，共檢測(cè)到5個(gè)Cd脅迫相關(guān)QTLs，根長、芽長未檢測(cè)到相同QTLs，說明鎘脅迫下控制水稻根長、芽長的遺傳機(jī)制可能存在差異，表明水稻耐鎘脅迫遺傳機(jī)制的復(fù)雜性，且于不同環(huán)境及不同群體所檢測(cè)到的基因位點(diǎn)存在較大差異。鎘脅迫和非鎘脅迫條件下定位的QTLs不同，表明Cd脅迫與正常環(huán)境下控制根長或芽長基因不同，這與李煒星等[29]和黃鳳林[31]的研究結(jié)果類似。此外，所檢測(cè)Cd脅迫相關(guān)QTLs的貢獻(xiàn)率為6.45%～19.46%，其中qCdRL7貢獻(xiàn)率最大，表明耐Cd脅迫雖然是數(shù)量性狀基因控制，但存在主效QTL。因此，在今后Cd脅迫分子育種中，選擇耐Cd主效QTL的同時(shí)應(yīng)聚合更多耐Cd脅迫的QTLs，提高育種效率。本研究檢測(cè)的5個(gè)萌芽期耐Cd脅迫QTLs中，qCdBL3、qCdBL8.1和qCdBL8.2增效等位基因均來自于廣親和粳稻02428，因此在今后的育種中可以利用02428為中間材料，可通過連鎖分子標(biāo)記，將這些水稻萌芽期耐Cd的QTLs導(dǎo)入其他水稻品種中，來提高水稻耐鎘能力；同理，增效等位基因均來自于秈稻昌恢891的qCdBL9，可通過連鎖分子標(biāo)記，將其導(dǎo)入其他秈稻品種中，以此來提高秈稻的耐鎘能力。