朱亮,屠玨,王德軍

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究所,杭州 310053)

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系為研究者提供了取之不盡、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究材料。利用細(xì)胞系模擬人體生物學(xué)機(jī)制,檢測治療效果以及合成治療用蛋白已成為常用的研究手段。在動物細(xì)胞使用過程中,細(xì)胞系誤用、細(xì)胞系間交叉污染和長期傳代導(dǎo)致細(xì)胞遺傳變異這三個問題長期困擾著學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界[1-5]。

針對人源細(xì)胞,研究者開發(fā)了多種細(xì)胞來源鑒定方法,主要有染色體核型分析、同工酶分析、多位點(diǎn)DNA指紋分析、短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats,STR)標(biāo)記檢測、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)分析、RNA序列分析,乃至全基因組測序分析。從檢測準(zhǔn)確度、技術(shù)普及度、人力物力和時間成本各方面綜合考慮,目前STR標(biāo)記檢測法是最佳選擇。2011年美國國家標(biāo)準(zhǔn)學(xué)會(ANSI)和美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)發(fā)布了人源細(xì)胞系STR標(biāo)記檢測標(biāo)準(zhǔn),對人源細(xì)胞系鑒定的必要性和操作方法進(jìn)行了詳盡的說明[6],確立了STR標(biāo)記檢測法在細(xì)胞系身份鑒定中的核心地位。美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、德國微生物與細(xì)胞保藏中心(DSMZ)、日本研究生物資源細(xì)胞庫(JCRB)和日本理化研究所生物資源中心(RIKEN)等權(quán)威細(xì)胞庫都對保藏的人源細(xì)胞系進(jìn)行了STR標(biāo)記檢測,并建立了人源細(xì)胞系STR標(biāo)記數(shù)據(jù)庫。

與人源細(xì)胞相比,非人源細(xì)胞污染現(xiàn)象同樣嚴(yán)峻,但受到的關(guān)注比較少,鑒定技術(shù)發(fā)展較慢。德國最權(quán)威的細(xì)胞庫DSMA對其保藏非人源細(xì)胞系檢測結(jié)果顯示,細(xì)胞交叉污染率為6%,而人源細(xì)胞交叉污染率為10%[7]。日本RIKEN生物資源中心的研究顯示,該中心保藏的小鼠細(xì)胞系錯誤率為4.2%,與該中心人源細(xì)胞系錯誤率相當(dāng)[8]。因此,非人源細(xì)胞系,尤其是常用的哺乳類實(shí)驗(yàn)動物細(xì)胞系急需準(zhǔn)確可靠的身份鑒定技術(shù)。

目前,非人哺乳類動物細(xì)胞系身份鑒定技術(shù)的研究報(bào)道僅見于小鼠、中國倉鼠和非洲綠猴。本文將對這3個物種的細(xì)胞系鑒定技術(shù)進(jìn)行總結(jié),旨在讓使用相關(guān)細(xì)胞的研究人員對其有一個系統(tǒng)的認(rèn)識。

1 小鼠細(xì)胞系鑒定

在研究人類基因和疾病的過程中,小鼠是最常用的模型系統(tǒng)。小鼠細(xì)胞被用于重組蛋白的生物工程制造[9],也被作為滋養(yǎng)層細(xì)胞用于胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)[10]。尤其是伴隨著以CRISPR/Cas9為代表的基因技術(shù)的進(jìn)步,越來越多的基因工程小鼠和新細(xì)胞系在研究中產(chǎn)生,需要有可靠的方法進(jìn)行區(qū)分鑒別。

相比人源細(xì)胞,小鼠細(xì)胞身份鑒定較困難,鑒定方法還沒有像人源細(xì)胞那樣被充分建立。這主要是因?yàn)榇蟛糠值男∈蠹?xì)胞系來源于少數(shù)近交品系,廣泛的雜交使得大量等位基因在不同小鼠品系間分布,而人源細(xì)胞的來源不存在近交和品系雜交的現(xiàn)象。因此,完全參照人源細(xì)胞鑒定使用的STR標(biāo)記檢測法,無法滿足精確鑒定小鼠細(xì)胞系的要求。

1992年,麻省理工學(xué)院的Dietrich等[11]發(fā)布了小鼠遺傳連鎖圖,包括317個STR標(biāo)記,覆蓋99%的小鼠基因組。這317個STR標(biāo)記被稱為MIT標(biāo)記,被廣泛用于多領(lǐng)域,也成為小鼠細(xì)胞系鑒定用STR標(biāo)記的來源。經(jīng)過長期的研究和改進(jìn),一個包括18個小鼠STR標(biāo)記和2個人STR標(biāo)記(用于鑒別種間污染)的組合表現(xiàn)出了較高的鑒定精度。該技術(shù)在來自美國、英國和瑞士的12個實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行了檢測比對試驗(yàn),結(jié)果顯示條帶一致率保持在92%以上。證明其能夠?qū)崿F(xiàn)小鼠細(xì)胞系的鑒定[12]。但小鼠STR標(biāo)記也有其局限性:在多次傳代細(xì)胞系中的穩(wěn)定性和近緣品系鑒別中的分辨力表現(xiàn)不穩(wěn)定[12-13],以及無法檢出細(xì)胞傳代中出現(xiàn)的染色體拷貝數(shù)變化[14-16]。

SNP的全稱是單核苷酸多態(tài)性,即由單個核苷酸堿基的改變而導(dǎo)致的核酸序列的多態(tài)性。盡管就單個SNP標(biāo)記而言只有兩種變異體,變異程度不如STR標(biāo)記,但SNP標(biāo)記在基因組中數(shù)量巨大,分布頻密。因此就整體而論,它們的多態(tài)性要高于STR標(biāo)記。SNP標(biāo)記與STR標(biāo)記的鑒別效率相似[17],且SNP標(biāo)記能夠能夠檢出細(xì)胞核倍數(shù)改變,彌補(bǔ)STR標(biāo)記的局限性。但是SNP標(biāo)記檢測成本較高,尚未建立標(biāo)準(zhǔn)化的檢測流程。目前在小鼠細(xì)胞系身份鑒定中,SNP標(biāo)記檢測常被作為STR標(biāo)記檢測的補(bǔ)充方法使用。

2 中國倉鼠卵巢細(xì)胞鑒定

中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細(xì)胞是外源真核基因的最佳蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一,也是生物制藥中最常用的哺乳動物細(xì)胞。為了規(guī)范依托CHO的重組蛋白表達(dá)生產(chǎn)系統(tǒng),避免細(xì)胞污染和錯用,有必要對CHO細(xì)胞進(jìn)行來源鑒定。

美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院(NIST)正在研發(fā)針對CHO細(xì)胞系的STR標(biāo)記,截止2017年9月,已經(jīng)篩選得到7個四堿基重復(fù)STR標(biāo)記,能夠在中國倉鼠基因組DNA中穩(wěn)定擴(kuò)增,同時無法在其他嚙齒類動物中獲得擴(kuò)增產(chǎn)物,說明其具有中國倉鼠物種特異性,可以滿足種間鑒別的要求。穩(wěn)定性研究顯示,這7個STR標(biāo)記在CHO-K1細(xì)胞系中產(chǎn)生的檢測結(jié)果,可以在傳代35代后保持結(jié)果不變,具有高度穩(wěn)定性[18]。NIST研究小組正在開發(fā)更多的STR標(biāo)記,以達(dá)到種內(nèi)鑒別的目標(biāo)。

3 非洲綠猴細(xì)胞鑒定

非洲綠猴(African green monkey)屬靈長目、獼猴科。1962年從非洲綠猴的腎上皮細(xì)胞中分離培養(yǎng)得到的異倍體細(xì)胞(Vero cells)被廣泛用于病毒擴(kuò)增、疫苗開發(fā)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)[19-24]。

為監(jiān)控和防止非洲綠猴細(xì)胞的錯用和污染,研究者建立了Vero細(xì)胞的STR標(biāo)記鑒定體系。目前沒有非洲綠猴的基因組數(shù)據(jù),但其與人類的近緣性使得其與人類共享大量STR區(qū)域。Almeida等[25]根據(jù)以下四個標(biāo)準(zhǔn)從大量人STR標(biāo)記中篩選出8個組成非洲綠猴鑒定體系:(1)雜合度高于50%;(2)每個位點(diǎn)有至少四個等位基因;(3)擴(kuò)增成功率高;(4)標(biāo)記重復(fù)單元為四堿基。以62只非洲綠猴基因組為材料的實(shí)驗(yàn)顯示,這8個STR標(biāo)記能夠精確區(qū)分來自不同非洲綠猴個體的細(xì)胞,誤差低至一百九十萬分之一[26]。但同時,研究者也指出,這8個STR標(biāo)記的組合無法分辨來自同一個體的不同細(xì)胞系。例如,來自同一只綠猴腎的COS-7細(xì)胞系和CV-1細(xì)胞系的基因組序列一樣,STR標(biāo)記檢測結(jié)果也一樣,需要通過SV40 T抗原檢測來區(qū)分[26]。

4 新的方法

STR標(biāo)記鑒定和SNP標(biāo)記鑒定是目前非人源動物細(xì)胞身份鑒定的常用方法。兩者都局限于基因組的特定區(qū)域,無法全面檢測各種類型的序列變化。隨著二代測序技術(shù)成本和檢測周期的持續(xù)下降,利用測序技術(shù)來鑒定細(xì)胞身份成為可能[27]?；谛蛄行畔⒌募?xì)胞鑒定方法中最被看好的是RNA測序法。

RNA序列檢測最早在2014年被用來驗(yàn)證人肺癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞來源和污染情況[28-29]。后來研究者嘗試將其應(yīng)用于細(xì)胞系鑒定。Mohammad等[30]收集了934個常用人細(xì)胞系的RNA序列信息,并建立數(shù)據(jù)庫,提供比對服務(wù)。細(xì)胞使用者只需要將序列比對信息(bam file)或序列變異信息(vcf file)輸入,數(shù)據(jù)庫就會進(jìn)行配對比較并返回最匹配的細(xì)胞名稱。如果匹配度低,數(shù)據(jù)庫還能推測可能的污染細(xì)胞。相較于STR或SNP標(biāo)記法只局限于有限的固定區(qū)域,RNA法測序法的最大優(yōu)勢在于其以完整的轉(zhuǎn)錄組變異數(shù)據(jù)為判斷依據(jù),從而避免了前者由于等位基因丟失導(dǎo)致的錯判。在等位基因重疊率較高的實(shí)驗(yàn)動物中,這一優(yōu)勢顯得格外有意義。

5 結(jié)語

目前,已建立的非人哺乳動物細(xì)胞身份鑒定技術(shù)僅針對小鼠、中國倉鼠和非洲綠猴3個物種,技術(shù)以STR標(biāo)記檢測法為主。覆蓋物種少,分析軟件單一,數(shù)據(jù)庫完善程度參差不齊是該領(lǐng)域有待解決的問題。

首先,增加檢測物種。需要建立針對更多物種,尤其是在生物醫(yī)學(xué)研究中越來越重要的實(shí)驗(yàn)動物的細(xì)胞系身份鑒定方法,以規(guī)范科學(xué)研究中動物細(xì)胞的使用,從而保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。其次,開發(fā)分析軟件。目前有很多軟件可用于測序片段的拼接、比對和變異識別,但絕大部分是針對人類測序數(shù)據(jù)的。針對非人哺乳動物細(xì)胞鑒定的分析軟件數(shù)量少且功能有限。因此,針對非人物種的序列拼接、比對和變異識別工具的開發(fā)將是未來發(fā)展的重點(diǎn)。最后,完善數(shù)據(jù)庫。細(xì)胞系STR標(biāo)記鑒定法很大程度上依賴于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與已有數(shù)據(jù)的比對,分析軟件的開發(fā)必定基于相關(guān)數(shù)據(jù)庫的建立和完善。如果沒有詳實(shí)全面的數(shù)據(jù)作為基礎(chǔ),就不能保證后續(xù)分析是基于合理的前提假設(shè),那么得出的結(jié)論就不可靠。甚至可以說,細(xì)胞遺傳信息數(shù)據(jù)庫的建立和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)本身同等重要。