劉校彤呂光華王巧稚*王瓊

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中葡中醫(yī)藥國(guó)際合作中心,四川 瀘州 646000;2.西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,四川瀘州 646000;3.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院,成都 611137;4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193)

20世紀(jì)60年代以來,陳可冀院士課題組在繼承傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)上,結(jié)合現(xiàn)代創(chuàng)新與發(fā)展,系統(tǒng)地研究了血瘀證的科學(xué)內(nèi)涵與活血化瘀療效機(jī)制[1]。自此,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于活血化瘀與血瘀證的研究也就正式拉開了帷幕。傳統(tǒng)中醫(yī)上的血瘀證是指脈管內(nèi)血行遲滯,或血溢脈外而停蓄體內(nèi)所引起的證候。隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步和發(fā)展,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要著眼于血瘀證引起的血液流變學(xué),生化以及組織形態(tài)學(xué)方面的改變。血瘀證模型的制備,就是建立在傳統(tǒng)中醫(yī)理論和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)結(jié)合的基礎(chǔ)之上。根據(jù)血瘀證不同的病因病機(jī),血瘀證模型可以分成:氣滯血瘀(qi-stagnancy and blood stasis)、氣虛血瘀(qideficiency and blood stasis)、外傷血瘀(trauma and blood stasis)、血虛血瘀(blood-deficiency and blood stasis)、寒凝血瘀(cold and blood stasis)、陽虛血瘀(yang-deficiency and blood stasis)、陰虛血瘀(yindeficiency and blood stasis)、痰濁血淤(phlegm-turbid blood stasis)、熱毒血瘀(heat-toxin and blood stasis)、慢性血瘀(chronic blood stasis)本文綜述血瘀證模型及研究進(jìn)展,為血瘀證模型相關(guān)科學(xué)研究作參考,為活血化瘀藥物篩選提供可選模型建議。

1 血瘀證動(dòng)物模型

1.1 氣滯血瘀

氣是構(gòu)成人體和維持生命的基本物質(zhì),氣為一切的生化本原。氣與血都根源于腎中精氣,滋生于脾胃化生的水谷精微和肺吸入的清氣,故稱為“氣血同源”。氣能生血,氣能行血,氣能攝血。血能養(yǎng)氣,血能載氣。氣血共同為患,同盛同衰,相互轉(zhuǎn)化?！端貑枴ふ{(diào)經(jīng)論》說“氣血不和,百病乃變化而生”。氣滯,則血行不暢,導(dǎo)致血瘀,出現(xiàn)血瘀證候。

(1)單因素刺激模型

章正祥等[2]通過對(duì)大鼠血液流速的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),采用腎上腺素皮下注射的方法形成氣滯血瘀狀態(tài),血流流速明顯減慢。通過給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射腎上腺素來模擬人體情志的變化,影響氣機(jī)造成氣滯血瘀模型。

(2)多因素刺激模型

廖婉等[3]采用連續(xù)7 d對(duì)大鼠進(jìn)行肌肉注射10 mL/kg的氫化可的松,聯(lián)合皮下注射腎上腺素的方法成功復(fù)制氣滯血瘀模型,通過對(duì)全血粘度(whole blood viscosity,WBV),血漿粘度(plasma viscosity,PV),紅細(xì)胞聚集指數(shù),血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)和血細(xì)胞壓積(hematocrit,HCT)的檢測(cè),顯示出醋莪術(shù)對(duì)氣滯血瘀大鼠的改善效果。鄭躍等[4]采用不可預(yù)知的慢性長(zhǎng)期刺激復(fù)制氣滯血瘀證動(dòng)物模型,具體包括:每隔8～15 min進(jìn)行1次,每次60～120 s的對(duì)大鼠足底25～35 V的電擊刺激;每隔8～15 min進(jìn)行1次,每次60～120 s的頻率為5～15 KHz的噪聲刺激(等級(jí)為3級(jí)),持續(xù)10～12 h;每隔8～15 min進(jìn)行1次,每次60～120 s的頻率為1～3 KHz強(qiáng)度的閃爍光刺激,持續(xù)10～12 h;進(jìn)行每小時(shí)1次持續(xù)4 min的夾尾,每天8次;進(jìn)行連續(xù)21 d,每日1次45°傾斜鼠籠2 h。通過對(duì)TNF-α、TLR2基因與蛋白的表達(dá)檢測(cè),顯示出膈下逐瘀湯加減方對(duì)氣滯血瘀大鼠的確切療效。劉丹彤等[5]采用夾尾、束縛后腿、食用油灌胃聯(lián)合皮下腎上腺素注射復(fù)合造模,具體為:用貼有紗布的止血鉗夾鼠尾,使動(dòng)物保持激惹爭(zhēng)斗狀態(tài),每周1次,每次2 min;繃帶束縛大鼠后肢使之行走困難,每周1次,每次30 min;食用油(0.01 mL/g)灌胃,每周1次;每只大鼠0.2 mL(1 g/L)腎上腺素皮下注射,每周1次。以上操作1周內(nèi)交替進(jìn)行。通過檢測(cè)多巴胺(dopamine,DA)、去甲腎上腺素(noradrenaline,NE)的含量,顯示氣滯血瘀證的體內(nèi)變化,提示模型復(fù)制成功。

1.2 氣虛血瘀

氣虛主要由于體內(nèi)元?dú)獠蛔愣鸬?元?dú)獠蛔銓?dǎo)致氣虛,使運(yùn)血無力,血行變緩,從而引起血性不暢導(dǎo)致血瘀。從病因上思考,致氣虛的因素有:(1)體虛致氣虛;(2)生氣之源減少;(3)正氣消耗增加;(4)情志失調(diào)致氣虛[6]。將以上幾點(diǎn)轉(zhuǎn)化為造模因素則有:饑餓、力竭、驚恐、疲勞等因素。

(1)單因素刺激模型

扈新剛等[7]在“勞則耗氣”的理論基礎(chǔ)上,使用游泳力竭的方法造模,力竭的標(biāo)準(zhǔn)為:大鼠沉入水中10 s不能自行浮出水面?？梢姶笫缶癫睢⒒顒?dòng)減少、體重下降、反應(yīng)遲緩等表征,檢測(cè)凝血酶原時(shí)間(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time,APTT)出現(xiàn)縮短,血漿粘度升高。徐海蓉[8]采用游泳力竭的方法造模,具體為將大鼠放入恒溫水槽中游泳14 d,每次持續(xù)時(shí)間為50%的大鼠出現(xiàn)自然沉降。造模后,大鼠出現(xiàn)毛色暗淡,舌質(zhì)紫暗,活動(dòng)減少。檢測(cè)血漿血栓素B2(thromboxane B2,TXB2)和腦組織一氧化氮(nitric oxide,NO)含量,都表現(xiàn)出升高的現(xiàn)象,提示造模成功。而“勞則耗氣”的方法除了游泳力竭之外,還有疲勞跑步運(yùn)動(dòng)法。根據(jù)這個(gè)理論,黃爍等[9]采用疲勞跑步運(yùn)動(dòng)的方法造模。具體是讓大鼠在跑臺(tái)水平狀態(tài)中進(jìn)行每天1次為期2周中等強(qiáng)度的跑步運(yùn)動(dòng),觀察到大鼠出現(xiàn)精神萎靡、被毛無光、活動(dòng)度降低、大便稀,鼻尖、口唇、舌面均發(fā)生不同程度的紫暗。呼吸幅度和脈搏都顯著下降,檢測(cè)見全血粘度切變率均出現(xiàn)升高。王磊沙等[10]采用每天睡眠剝奪16 h(每天16:00～8:00)的方法造模。舌面可見散布的瘀點(diǎn),舌下脈絡(luò)紫暗,便溏。檢測(cè)可見全血粘度切變率均明顯升高,PT縮短。

(2)多因素刺激模型

許穎智等[11]選用饑餓、疲勞和寒濕刺激的因素造模,具體為:根據(jù)體重計(jì)算,給予大鼠40 g/kg的飼料,在室溫(15±1)℃下,強(qiáng)迫大鼠游泳至疲勞,平均(10±5)min后,不予以保溫任其晾干。可觀察到大鼠倦怠萎靡、毛發(fā)稀疏呈黃白色、反應(yīng)慢、胸前皮膚顏色淡暗。檢測(cè)可見血小板聚集率(platelet aggregation rate,PAG)升高,血漿顆粒膜蛋白-140(plasma granule membrane protein-140,GMP-140)水平升高,降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)水平降低。任建勛等[12]使用日夜顛倒+不可預(yù)知的慢性睡眠剝奪復(fù)合半高脂高糖飲食的方法造模。具體為:在半高脂高糖飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上,使用常相光照(8:00～20:00光照,20:00～8:00黑暗)、反相光照(8:00～20:00黑暗,20:00～8:00光照)、持續(xù)光照(24 h光照)及持續(xù)黑暗(24 h黑暗)4個(gè)過程(為1個(gè)階段),每個(gè)階段7 d,連續(xù)重復(fù)6周,在每個(gè)階段中隨機(jī)安排以上4個(gè)過程,每個(gè)階段對(duì)大鼠進(jìn)行48 h的睡眠剝奪,當(dāng)大鼠進(jìn)入睡眠時(shí),給予低壓電刺激,使大鼠保持清醒無法進(jìn)入睡眠狀態(tài)。檢測(cè)見全血粘度低切變率、血清總膽固醇(total cholesterol,TC)與低密度脂蛋白膽固醇(lowdensity lipoprotein cholesterol,LDL-C)都出現(xiàn)顯著升高,血漿血管緊張素II(angiotensin II,Ang II)含量,內(nèi)皮素(endothelin,ET)含量明顯升高。張玉昆等[13]選取老年大鼠復(fù)合一次性向氣管內(nèi)注射博來霉素制備模型,檢測(cè)可見全血粘度低中切變率升高,血小板體積分布寬度(platelet volume distribution width,PDW)和血小板平均體積(mean platelet volume,MPV)升高,環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)水平降低,環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)水平升高,TT和PT縮短,血小板因子4(platelet factor 4,PF4)水平和纖溶酶原激活抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)水平升高。彭桂原等[14]使用耗氣破氣加饑飽失常法共15 d造模,具體為:采用“足量給食-限量給食”的循環(huán)方法,使用“小承氣湯”作為破氣苦降藥,給藥當(dāng)天禁食,次日自由進(jìn)食。造模后,觀察到模型組豚鼠精神萎靡,行動(dòng)遲緩,便溏,被毛有不同程度枯槁脫落,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)血清D-木糖的濃度降低,病理檢查corti器的內(nèi)毛細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)毛細(xì)胞有變性、壞死和缺失的情況。

1.3 血虛血瘀

氣血同源,“氣為血之帥,血為氣之母”。血虛則氣虛,氣虛則血行不利形成瘀證。常復(fù)蓉等[15]采用股動(dòng)脈放血的方法制備模型,每天放1.5%的血量,總放血量為家兔自身總血量的50%左右。放血結(jié)束后檢測(cè)結(jié)果與放血前對(duì)比可見,家兔的紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白(hemoglobin,HB)降低,WBV和PV升高,HCT降低,紅細(xì)胞變形能力下降;TT和PT降低,纖維蛋白原(fibrinogen,FIB)升高;NE降低,酸性α-萘乙酸酯酶(acid-naphthoacetate esterase,ANAE)降低,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)降低,TXB2升高。金翔等[16]采用皮下注射乙酰苯肼和腹腔注射環(huán)磷酰胺的方法復(fù)制模型,具體為:對(duì)大鼠在第1天和第3天時(shí),以0.005 mL/g的劑量皮下注射乙酰苯肼,第3天注射后2 h,腹腔注射0.005 mL/g的環(huán)磷酰胺,此后連續(xù)3 d行同劑量的環(huán)磷酰胺腹腔注射。微循環(huán)圖像分析儀觀察可見,大鼠耳廓微血管血流量降低,血流速減緩。

1.4 外傷血瘀

由例如創(chuàng)傷、跌打損傷及金刃損傷等多種原因所致的脈管破損,致使血溢于脈外,成為離經(jīng)之血后未能及時(shí)消散或排出體外,積聚于體內(nèi)后而形成淤血。魏榮銳等[17]用鐵杵擊大鼠右后肢軟組織,使之形成外傷血瘀模型,具體為:實(shí)驗(yàn)前1 d將大鼠右后肢脫毛并測(cè)量其周長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)當(dāng)天,以鈍器自由落體擊傷大鼠右后肢,造成肉眼可見的皮下出血伴有明顯腫脹的非開放性軟組織損傷,再測(cè)量周長(zhǎng)并評(píng)分。觀察損傷部位可見皮下淤血,組織腫脹,肌肉顏色暗紅或紫暗。檢測(cè)可見全血粘度和紅細(xì)胞聚集指數(shù)升高,全血粘度切變率均升高。沈欣等[18]選用擊打高度10.5 cm,重1013 g的落體擊打儀,自由落體擊打大鼠右小腿的中部外側(cè)。可見大鼠真皮及皮下組織,肌外膜、肌束膜和肌纖維間出現(xiàn)不同程度的出血、滲出和炎細(xì)胞浸潤(rùn);肌纖維間距增大、存在不同程度的變性、壞死。

1.5 寒凝血瘀

《醫(yī)林改錯(cuò)·積塊》說:“血受寒則凝結(jié)成塊”。若外感寒邪入于血脈,或陰寒內(nèi)盛血脈攣縮,都會(huì)導(dǎo)致血液凝澀而運(yùn)行不暢,故血液在體內(nèi)瘀積不散,形成瘀血。

(1)單因素造模

王丹丹等[19]采用低溫冷凍法:將大鼠放置于0～1℃的冰水20 min,每日1次,連續(xù)兩周,形成大鼠的寒凝血瘀模型。觀察可見大鼠寒戰(zhàn),蜷縮少動(dòng),喜扎堆,爪尾部紫暗,耳色暗紅,舌質(zhì)紫暗,舌下脈絡(luò)增粗增長(zhǎng),便溏。吳卓霖等[20]采用改良暴露法造模,具體為,將大鼠放置于(-10±2)℃的低溫冰柜中,使用含91.5%氮和8.5%氧混合氣體的氣袋,放入冰柜內(nèi)并緩慢放氣,持續(xù)1 h后取出,每天1次,連續(xù)5 d。觀察到大鼠也出現(xiàn)蜷縮少動(dòng),食少便溏,被毛無光等體征。檢測(cè)可見全血黏度切變率,血漿黏度和紅細(xì)胞聚集指數(shù)皆升。唐照亮等[21]通過使用電扇每日4 h低速吹風(fēng),營(yíng)造出3～4級(jí)風(fēng)力、1℃～6℃的風(fēng)寒環(huán)境,使大鼠在此環(huán)境中持續(xù)低溫受凍3周造模。檢測(cè)可見大鼠血漿ET水平升高,NO水平降低,ET/NO比值增大。

(2)多因素造模

Dang等[22]采用靜脈注射去甲腎上腺素加牛血清蛋白復(fù)合冰水游泳的方法造模,在第1天和第10天對(duì)大鼠靜脈注射牛2.5 mg/kg的血清白蛋白,在4～17 d時(shí),每天2次靜脈注射0.02 mg/kg的去甲腎上腺素,在第18～24天時(shí),將大鼠放入0℃～4℃的冰水中游泳5 min。檢測(cè)可見PT、APTT、TT縮短,FIB含量升高,TXB2水平升高,6-keto-PGF1α水平降低,大鼠血漿的血栓素A2(thromboxane,TXA2)和ET水平升高,內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)和前列環(huán)素(prostacyclin,PGI2)的水平降低。劉丹等[23]采用冰水浴加腎上腺素注射法復(fù)制模型,具體是將大鼠連續(xù)7 d,每天1次放入0～1℃的冰水中5 min,第8天時(shí),對(duì)各模型組大鼠進(jìn)行2次1%腎上腺素(0.0008 mL/g)的皮下注射,2次間隔4 h。造模后可見大鼠稀便、少動(dòng)、毛色不榮、爪尾紫暗、尾涼及攝食減少。檢測(cè)可見全血粘度切變率升高,血漿粘度升高,ET含量升高,NO水平降低,血清IL-6、TNF-2α水平顯著升高。賈丹兵等[24]給大鼠皮下注射2次,間隔4 h的0.1%鹽酸腎上腺素0.0008 mL/g,第1次注射2 h后將大鼠浸泡在4℃的冰水中5 min造模。檢測(cè)可見全血粘度切變率升高,血漿粘度升高,紅細(xì)胞壓積明顯升高。

1.6 陽虛血瘀和陰虛血瘀

陰陽之間存在對(duì)立制約、互根互用、消長(zhǎng)平衡、相互轉(zhuǎn)化的關(guān)系。氣分陰陽,可推動(dòng)和調(diào)控血液運(yùn)行,陽虛則脈道失于溫通而滯澀,陰虛則脈道失于柔潤(rùn)而僵化,陰陽失衡則會(huì)影響氣、血、津液的輸布從而形成瘀證。

(1)陽虛血瘀

溫瑞興等[25]采用斷食1夜后將大鼠放入-15℃冷凍4 h造成陽虛血瘀的模型,檢測(cè)可見凝血時(shí)間縮短,但未見血漿粘度發(fā)生明顯變化,提出陽虛是導(dǎo)致機(jī)體功能下降區(qū)別于有形之瘀的證候。張明雪等[26]采取高脂飲食、寒冷刺激復(fù)合腦垂體后葉素注射的方法復(fù)制陽虛血瘀證模型。具體為:給予大鼠高脂飼料,將大鼠放于-2℃～-4℃的寒冷環(huán)境中持續(xù)6周,在第35天,皮下注射腦垂體后葉素(pit,10 U/kg)。造模后,大鼠出現(xiàn)心肌損傷且心功能減退的現(xiàn)象,心電圖顯示心肌缺血,檢測(cè)可見血脂和心肌酶升高,血小板聚集率升高。劉如秀等[27]采用甲醛加壓注射滲透法建立兔心陽虛血瘀證模型,在心電圖監(jiān)測(cè)下,推注0.01～0.02 mL 20%的甲醛直至心率下降30%～50%,或出現(xiàn)心律失常時(shí)停止。造模后可見兔體重減少、精神萎靡不振、蜷縮少動(dòng)、毛色枯槁、舌色暗紅或淡紫;可見兔體溫下降呼吸頻率增高、心率下降、單位時(shí)間內(nèi)游泳速率下降、全血粘度升高、全血粘度切變率升高、紅細(xì)胞聚集指數(shù)升高。

(2)陰虛血瘀

葉宏軍等[28]采取氫化可的松聯(lián)合腎上腺素造模,具體為:對(duì)大鼠連續(xù)14 d進(jìn)行肌肉注射10 mg/kg的氫化可的松注射液,在第14天和第15天取血前1 h皮下注射0.5 mg/kg的0.1%腎上腺素。通過檢測(cè)可見全血粘度切變率均升高,血漿粘度、血沉、紅細(xì)胞壓積和血小板黏附率均升高,血小板聚集率也同樣升高。卞慧敏等[29]采用每日皮下注射48 mg/kg的D-半乳糖,第32天開始,再聯(lián)合肌肉注射1.5 mg/kg地塞米松的方法,共39 d完成造模。經(jīng)檢測(cè)大鼠的PT、APTT出現(xiàn)明顯縮短,血小板聚集率升高,血漿PGI1α水平降低,TXB2和ET升高。

1.7 痰濁血淤

津液和血均來源于精氣,在運(yùn)行輸布中相互轉(zhuǎn)化,且都具有滋潤(rùn)濡養(yǎng)的作用,《內(nèi)經(jīng)》曰:津入脈管,變化而赤是謂血。可見津可入血,血可成津,二者相輔相成,一榮俱榮,一損俱損。血液不循常道成瘀,而津液不循常道則成痰濁。張蕾等[30]采用頸動(dòng)脈針控線拴法、維生素D3注射結(jié)合高脂飲食的方法造模。具體為:在大鼠的頸總動(dòng)脈旁平行放置直徑為0.06 mm的針頭,用6號(hào)尼龍線將兩者扎緊,抽出針頭待血流恢復(fù)后即可造成一定程度的頸總動(dòng)脈狹窄。術(shù)后第5天,連續(xù)3 d對(duì)大鼠注射維生素D3,同時(shí)給予高脂飼料喂養(yǎng)2～8周,分時(shí)間點(diǎn)取材檢測(cè)。檢測(cè)可見大鼠血脂和血膽固醇升高,全血粘度、血漿粘度和紅細(xì)胞壓積升高。HE染色可見頸動(dòng)脈內(nèi)皮和中膜內(nèi)有脂滴和泡沫細(xì)胞,動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)破壞,彈力纖維斷裂等。王瑩威等[31]采用高脂飼料喂養(yǎng)8周的方法造模(配方:膽固醇1%,豬油15%,蛋黃粉15%和基礎(chǔ)飼料79%)。檢測(cè)可見TC、甘油三酯(triglyceride,TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平顯著升高,高密度脂蛋白膽固醇水平降低,miR-21和TGFβRⅡ的表達(dá)水平明顯升高。

1.8 熱毒血瘀

《醫(yī)林改錯(cuò)·積塊》所述:“血受熱則煎熬成塊”。外感火熱兩邪,或體內(nèi)陽盛而化火入血,血熱互結(jié)而煎灼血中津液,則血液黏稠運(yùn)行不暢;或熱灼脈絡(luò),迫血妄行使內(nèi)出血,以致血液滯于體內(nèi)不散成瘀。杜巧輝等[32]在末次給藥5 h后,給大鼠腹腔注射2.5 mL/kg的角叉萊膠溶液,8 h后再經(jīng)尾靜脈注射1 mL/kg的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)溶液,尾部出現(xiàn)明顯且肉眼可見的血栓為造模成功。觀察大鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、扎堆少動(dòng)、便溏、四肢癱軟無力。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大鼠白細(xì)胞升高,血小板和紅細(xì)胞降低,紅細(xì)胞壓積、全血粘度和全血粘度低切變率均升高。李妍等[33]采用LPS注射的方法對(duì)小鼠造模。具體為:首次以3 mg/kg的劑量經(jīng)尾靜脈注射LPS溶液,20 h后開始以4 mg/kg的劑量行腹腔注射,隔天1次,連續(xù)6周。觀察可見小鼠食量減少,呼吸頻率偏快,耳緣毛細(xì)血管變深紅甚至紫紅,雙眼球色暗紅,爪甲紫暗。小鼠耳緣血管網(wǎng)、足趾血管網(wǎng)、腹壁靜脈局部的血流量均減少,檢測(cè)可見小鼠血粘度升高,全血粘度低中高切變率均升高。

1.9 慢性血瘀

《內(nèi)經(jīng)》說:“六十歲,心氣始衰,苦憂悲,血?dú)庑付??！薄夺t(yī)林改錯(cuò)》指出:“元?dú)饧忍?必不能達(dá)于血管,血管無氣,必停留成瘀”。衰老后,元?dú)馑ト?因氣血同源,故血行減緩易滯成瘀。毛騰敏等[34]選擇24～27月鼠齡的老年大鼠為模型研究,檢測(cè)全血粘度低、高切變率,血漿比粘度和血清比粘度,出現(xiàn)升高的現(xiàn)象;紅細(xì)胞電泳速度降低,紅細(xì)胞變形能力下降,電刺激老年鼠頸動(dòng)脈后,體內(nèi)血栓形成時(shí)間明顯縮短,老齡鼠的體外血栓長(zhǎng)度、濕重和干重均有增加,血漿膽固醇含量明顯增高。賈景景等[35]采取每日1次,連續(xù)7周對(duì)大鼠皮下注射100 mg/kg D-半乳糖復(fù)制模型。造模后發(fā)現(xiàn)大鼠下肢基礎(chǔ)微循環(huán)灌注量降低,檢測(cè)可見血小板聚集率、纖維蛋白原和丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平均升高,SOD活性降低。

2 實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)方法

2.1 模型動(dòng)物的一般情況

雖然血瘀證的分型很多,但在造模表現(xiàn)上存在著一定的相似性。血瘀證的動(dòng)物模型,均表現(xiàn)有毛色暗淡無光、舌質(zhì)暗紅或淡紫、運(yùn)動(dòng)量減少、精神萎靡、食少便溏、大小鼠可見爪甲紫暗及尾涼蜷縮。

2.2 血液指標(biāo)選取

血瘀證在血液流變學(xué)的改變是現(xiàn)在公認(rèn)的客觀指標(biāo),故選擇的指標(biāo)有:全血粘度切變率(WBV),血漿粘度(PV),紅細(xì)胞壓積(HCT),血沉(ESR)。血瘀證也會(huì)引起凝血功能的改變,故:血漿凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)、纖維蛋白原(FIB)也被納入考慮范圍。血液的瘀滯和血栓的形成和血小板相關(guān)指標(biāo)也有關(guān):血小板體積分布寬度(PDW)、血小板平均體積(MPV)、血小板聚集率(PAG)。

2.3 生化指標(biāo)選取

慢性血瘀證以及高脂飼料喂養(yǎng)的動(dòng)物模型可有生化指標(biāo)的改變,故可選取:總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)。

2.4 血漿中特定指標(biāo)的選取

血瘀證的微觀病理改變和血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷關(guān)系密切[36]。血漿內(nèi)皮素(ET)、血栓素A2(TXA2)、血栓素B2(TXB2)、血管緊張素II(Ang II)、前列環(huán)素(PGI2)、前列腺素E2(PGE2)、一氧化氮(NO)、超敏C反應(yīng)蛋白(high sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、血漿顆粒膜蛋白-140(GMP-140)、纖溶酶原激活抑制物-1(PAI-1)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)。

2.5 輔助檢測(cè)

可以選擇激光多普勒血流儀,微循環(huán)圖像分析儀觀測(cè)耳朵、腳趾、腹部血管的血流值。因?yàn)檠鲎C和血管內(nèi)皮損傷存在一定的聯(lián)系,故可以選擇和

血管內(nèi)皮損傷有關(guān)的蛋白進(jìn)行檢測(cè),如:內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血管性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF)、內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(endothelial cell protein C receptor,EPCR)等。r

表2 模型表現(xiàn)和指標(biāo)Table 2 Model performance and indicators

2.6 組織形態(tài)學(xué)觀察

可以通過取動(dòng)脈做蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE),觀察對(duì)比實(shí)驗(yàn)組的血管內(nèi)皮形態(tài);還可選擇電刺激大鼠頸動(dòng)脈產(chǎn)生血栓的方法,通過測(cè)量血栓的長(zhǎng)度,干重和濕重來評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)用藥的效果。

3 模型特點(diǎn)

血瘀證模型因其病因病機(jī)較多,故而出現(xiàn)較多分型和造模方法,不同造模方法的原理,造模周期和模型表現(xiàn)以及相關(guān)的指標(biāo)選取也有一些差異,在此將前述各模型相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行匯總(見表1、2)。

表1 血瘀證模型相關(guān)內(nèi)容匯總Table 1 Summary of related content of blood stasis model

4 小結(jié)與展望

近年來,隨著對(duì)血瘀證研究的不斷深入和完善,血瘀證的動(dòng)物模型得以改進(jìn)和充實(shí),其造模原理也主要體現(xiàn)在病因病機(jī)與證候的結(jié)合。所有的血瘀證動(dòng)物模型,在血液流變學(xué)上都體現(xiàn)出了“粘”、“濃”、“凝”、“聚”的特點(diǎn)。血瘀證常夾雜多種證候出現(xiàn),用單一的刺激因素作用于模型并不能完全滿足實(shí)際需要,故而現(xiàn)在常選擇多因素復(fù)合刺激進(jìn)行血瘀證的模型復(fù)制。這樣的模型既符合中醫(yī)對(duì)于血瘀證的診斷,又能在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的血液流變學(xué)上得到體現(xiàn)。

然而,現(xiàn)在的模型雖然可以模擬一部分證候,但在臨床上血瘀證常因氣血兩虛,情志失調(diào)導(dǎo)致氣機(jī)紊亂,以及環(huán)境因素相互作用而產(chǎn)生。目前已有模型還難以將血瘀證雜糅的證候完全體現(xiàn),在這一點(diǎn)上還需進(jìn)一步探索。再者,血瘀證模型常需通過施加病理因素誘發(fā)產(chǎn)生,這與人類的實(shí)際發(fā)病情況并不完全一致,另有一部分自然成瘀的模型耗時(shí)較長(zhǎng)難以模擬。對(duì)于今后的模型復(fù)制而言,延續(xù)和改進(jìn)現(xiàn)有的造模原理和方法,采用較為溫和的造模方式仍很重要。在保證動(dòng)物福利前提下,可通過結(jié)合多種因素,例如:在結(jié)合環(huán)境和模擬人體情志變化復(fù)合飲食節(jié)律的基礎(chǔ)上,延長(zhǎng)造模時(shí)間等方式,或采用更加貼近人體發(fā)病后“久病成瘀”的特點(diǎn)進(jìn)行造模,可能更為接近血瘀證特點(diǎn)?？傊?更科學(xué)、合理、接近臨床特點(diǎn)的模型制作仍是血瘀證相關(guān)研究及活血化瘀藥物篩選的關(guān)鍵環(huán)節(jié),相信通過更優(yōu)的模型制作,可為中醫(yī)藥學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究發(fā)展提供重要參考。