沈科展,吳學(xué)文,何淑崢,孫鑫,周之東,朱雨鑫,陳揚(yáng),方劍喬,房軍帆,杜俊英

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院康復(fù)醫(yī)學(xué)院 浙江省針灸神經(jīng)病學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310053)

疼痛是實(shí)際或潛在組織損傷相關(guān)的一種不愉悅的感覺(jué)和情感體驗(yàn)[1]。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì),慢性痛在某些不發(fā)達(dá)地區(qū)的發(fā)病率高達(dá)76%[2],其中,50%伴發(fā)痛情緒[3]。慢性痛引發(fā)的焦慮、抑郁、厭惡等情緒,長(zhǎng)期甚至終生折磨患者[4-5]。其中痛厭惡情緒可產(chǎn)生過(guò)度警覺(jué),易激惹性增高,極力回避疼痛事件的再現(xiàn)等病理行為,常并發(fā)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder,PTSD)等心理問(wèn)題[6-7],嚴(yán)重降低生活質(zhì)量。目前臨床上對(duì)焦慮、抑郁的治療仍主要依賴藥物,但長(zhǎng)期應(yīng)用不良反應(yīng)顯著[8],探尋低毒高效的治療方法緩解慢性痛和調(diào)節(jié)痛情緒已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)神經(jīng)與鎮(zhèn)痛領(lǐng)域的前沿問(wèn)題。

電針作為一種安全有效鎮(zhèn)痛、抗焦慮的常用療法[9-10],具有潛在優(yōu)勢(shì)。臨床研究表明其對(duì)慢性痛,疼痛記憶引發(fā)的痛感覺(jué)及痛情緒的調(diào)節(jié)效佳[11-12]。前期實(shí)驗(yàn)觀察到電針對(duì)痛厭惡大鼠的焦慮情緒行為具有良好的調(diào)節(jié)作用且其與前扣帶皮層(anterior cingulate cortex,ACC)水平的神經(jīng)肽S/神經(jīng)肽S受體系統(tǒng)相關(guān)[13]。ACC是疼痛以及痛情緒信息傳導(dǎo)與調(diào)控的關(guān)鍵腦區(qū)[14-15],ACC內(nèi)N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)和γ-氨基丁酸(γaminobutyric acid,GABA)含量及其受體的表達(dá)與慢性痛的緩解相關(guān)[16-17]。據(jù)研究,提前介入電針治療對(duì)疼痛具有良好的干預(yù)作用[18]。但是不同時(shí)間點(diǎn)電針干預(yù)對(duì)痛厭惡大鼠的焦慮行為及機(jī)制是否一致尚無(wú)相關(guān)報(bào)道?；诖?本研究通過(guò)建立完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的條件位置回避(complete Freund’s adjuvant induced conditioned place avoidance,CCPA)痛厭惡大鼠模型,于造模前后進(jìn)行電針干預(yù),觀察其對(duì)痛厭惡大鼠的疼痛、焦慮情緒行為及ACC內(nèi)NMDAR和GABAR的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

32只6～7周清潔級(jí)健康雄性成年SD大鼠,體重(220±10)g,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(滬)2018-0006】,飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心【SYXK(浙)2018-0012】,維持適宜的室溫(22～26℃)和濕度(60%),環(huán)境安靜,通風(fēng)良好,晝夜各半循環(huán)光照,給予標(biāo)準(zhǔn)飼料及自由飲水。本實(shí)驗(yàn)所有操作均符合中華人民共和國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作(見(jiàn)圖1)均經(jīng)過(guò)浙江中醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)許可(倫理審批號(hào)為:IACUC-20180319-12)。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Figure 1 Experimental flow chart

通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠完全隨機(jī)分為4組:空白(NS)組(n=8)、模型(C-CPA)組(n=8)、常規(guī)電針(EA1)組(n=8)、預(yù)電針(EA2)組(n=8),每籠4只進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑與儀器

完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant,CFA)(美國(guó)Sigma公司),75%醫(yī)用消毒乙醇(杭州歐拓普生物技術(shù)有限公司),von Frey纖維絲測(cè)痛儀(美國(guó)Stoelting公司),韓式HANS-200 A穴位神經(jīng)刺激儀(南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司),高架O迷宮(elevated zero maze,EZM)、曠場(chǎng)(open field,OF)(瑞沃德生命科技有限公司),Smart 3.0分析軟件(美國(guó)Panlab公司),兔抗大鼠GABAAR、GABABR抗體、兔抗大鼠NR2A、NR2B抗體(美國(guó)Abcam公司),辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的驢抗兔二抗(美國(guó)Abcam公司),HRP標(biāo)記的βactin抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司),全能臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific公司),電泳-轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司),lmage Quant LAS4000型凝膠成像系統(tǒng)(德國(guó)GE公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立C-CPA痛厭惡模型

如圖2所示,參照Wu等[19]方法,CPA為黑色的不透光長(zhǎng)盒,中央被黑色活動(dòng)擋板等分成30 cm×30 cm×30 cm的A、B兩區(qū)。A區(qū)、B區(qū)分別在四面貼有間隔一致的三角形和圓形白色圖案,分別涂抹5%醋酸和肉桂油。條件化前(pre-conditioning day):將擋板取出,連通兩區(qū),放入大鼠使其自由活動(dòng),30 s適應(yīng)期后記錄10 min內(nèi)大鼠在兩區(qū)的停留時(shí)長(zhǎng),剔除對(duì)某區(qū)有偏好(停留時(shí)間≥7 min)的大鼠。隨機(jī)定義一區(qū)為“痛環(huán)境”區(qū),另一區(qū)為“非痛環(huán)境”區(qū)。條件化(conditioning day):擋板插入分隔兩區(qū),將大鼠放入“非痛環(huán)境”區(qū)45 min,之后放回飼養(yǎng)籠。2 h后C-CPA組、EA1組和EA2組大鼠左足底皮下注射0.1 mL CFA,NS組在相同部位注射0.1 mL生理鹽水(normal saline,NS)。6 h后將各大鼠放入“痛環(huán)境”區(qū)45 min,之后放回飼養(yǎng)籠。條件化后(post-conditioning day):與條件化前相同操作,記錄10 min內(nèi)大鼠在兩區(qū)的停留時(shí)長(zhǎng)。若在“痛環(huán)境”區(qū)的停留時(shí)長(zhǎng)較條件化前明顯減少,則C-CPA痛厭惡模型建立成功。用大鼠條件化后“痛環(huán)境”區(qū)的停留時(shí)長(zhǎng)減去條件化前在該區(qū)的停留時(shí)長(zhǎng)所得差值為回避分?jǐn)?shù)(CPA score)。每次實(shí)驗(yàn)后,用10%乙醇擦拭,清除排泄物,以消除前1只大鼠遺留的氣味。

圖2 C-CPA痛厭惡模型建立圖Figure 2 Establishment of C-CPA pain aversion model chart

1.2.2 電針干預(yù)

EA1組:建立C-CPA模型后開(kāi)始介入電針,將大鼠放置于特定的黑色布袋中,充分暴露雙下肢,用華佗牌0.18 mm×13 mm毫針刺入大鼠雙側(cè)“后三里穴”(膝關(guān)節(jié)后外側(cè),在腓骨頭下約5 mm處)、“昆侖穴”(后肢外踝與跟腱之間的凹陷中),韓式電針儀器連接。參照溫存等[20]干預(yù)參數(shù):2/100 Hz疏密波,強(qiáng)度先為0.5 mA,每10 min增加0.5 mA,共30 min,1次/日。

EA2組:造模前3 d開(kāi)始介入,模后操作、取穴和干預(yù)參數(shù)同EA1組。

1.2.3 機(jī)械縮足閾(paw withdrawal thresholds,PWTs)

采用Chaplan等[21]建立的Up-Down方法測(cè)定大鼠的機(jī)械縮足閾(PWTs)。保持環(huán)境安靜,室溫23℃左右。大鼠置于測(cè)痛架上適應(yīng)約30 min,待大鼠安靜后,采用von Frey纖維絲(0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0、26.0 g)垂直刺向大鼠左后足掌底中部皮膚(避開(kāi)足墊),刺激時(shí)纖維絲彎曲成S形并保持6～8 s。從4.0 g刺激強(qiáng)度開(kāi)始,若大鼠出現(xiàn)縮足、舔足或逃逸等陽(yáng)性反應(yīng)時(shí),記錄“X”,換相鄰小一級(jí)纖維絲刺激;若大鼠未出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)時(shí),記錄“O”,換相鄰大一級(jí)纖維絲刺激。第1次“O”和“X”交替出現(xiàn)后,再刺激4次,得到一串含“O”和“X”的序列。通過(guò)公式PWTs(g)=(10[xf+κδ])/10000計(jì)算大鼠的機(jī)械縮足閾(xf為最后一個(gè)有效符號(hào)所在的von Frey纖維絲上的log值,κ為陰性或陽(yáng)性反映符號(hào)排列所代表的值,δ為所有刺激強(qiáng)度log均差,實(shí)驗(yàn)中為0.231)。若所得序列為“OOOOO”或計(jì)算值≥26 g,則記為26 g;若所得序列為“XXXXX”或計(jì)算值≤0.4 g,則記為0.4 g。

1.2.4 高架O迷宮實(shí)驗(yàn)(elevated zero maze,EZM)

參照溫存等[20]方法,將待測(cè)大鼠放入實(shí)驗(yàn)室中適應(yīng)30 min,室溫23℃左右。開(kāi)始測(cè)試時(shí),將大鼠頭部面向開(kāi)放臂迅速輕置于閉合臂與開(kāi)放臂交界處。適應(yīng)30 s后,應(yīng)用Smart 3.0分析軟件記錄并統(tǒng)計(jì)大鼠5 min內(nèi)“開(kāi)放臂運(yùn)動(dòng)距離”、“開(kāi)放臂停留時(shí)間”、“開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)”和“總運(yùn)動(dòng)距離”。每次測(cè)試后,用10%乙醇擦拭高架O迷宮,清除大鼠殘留的排泄物和氣味,干燥后進(jìn)行下一次實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field,OF)

環(huán)境要求、適應(yīng)條件同高架O迷宮實(shí)驗(yàn)。開(kāi)始測(cè)試時(shí),將大鼠快速輕置于曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱正中區(qū)域。應(yīng)用Smart 3.0記錄并分統(tǒng)計(jì)大鼠5 min內(nèi)“中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離”、“中央?yún)^(qū)停留時(shí)間”、“中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)”、“總運(yùn)動(dòng)距離”。每次測(cè)試后,清理排泄物、去除氣味、干燥等同高架O迷宮實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 免疫印跡(Western Blot)

行為學(xué)結(jié)束后以4%的異氟烷麻醉大鼠,剖開(kāi)胸腹暴露心臟,用灌注針從左心房穿入升主動(dòng)脈,剪開(kāi)右心耳,快速灌注4℃生理鹽水每只200 mL,快速開(kāi)顱取出全腦,按照Paxinons&Watson的大鼠腦立體定位圖譜(第六版)獲取左側(cè)ACC核團(tuán),經(jīng)液氮后,置于-80℃保存。ACC中加入裂解液100μL(RIPA:PMSF:磷酸酶抑制劑=98∶1:1配置混合液),冰上剪碎,超聲粉碎儀(每次3 s,間隔12 s,6次)粉碎。14 000 r/min 4℃離心5 min,吸取上清液,用BCA法測(cè)濃度,1∶1加入2×SDS-PAGE上樣緩沖液,蛋白變性(煮沸10 min)。15μg蛋白上樣,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉1 h,兔抗大鼠β-actin(1∶5000),GABAAR(1∶5000),GABABR(1∶1000),NR2A(1∶1000),NR2B(1∶1000)的一抗置于4℃冰箱孵育過(guò)夜約16～18 h,TBST緩沖液清洗3次,每次10 min。室溫孵育HRP標(biāo)記的驢抗兔二抗(1∶5000)2 h,TBST緩沖液清洗3次同上。以βactin作為內(nèi)參,ECL發(fā)光試劑顯色,lmage Quant LAS4000凝膠成像系統(tǒng)拍攝,Image J軟件測(cè)量灰度值,將目的蛋白與β-actin灰度值的比值歸一化處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。兩組前后比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。若呈正態(tài)分布且方差齊,則組間兩兩比較采用S-N-K法;若不符合,采用Dunnett’s T3法。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,用GraphPad Prism 7.0軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié)果

2.1 C-CPA痛厭惡模型的建立

如圖3所示,NS組大鼠造模前后,“痛環(huán)境”中停留時(shí)間無(wú)明顯變化,C-CPA組、EA1組和EA2組大鼠造模后在“痛環(huán)境”中停留時(shí)間顯著減少(P<0.01)。與NS組比較,C-CPA組、EA1組和EA2組大鼠的CPA scores明顯減少(P<0.01),且三組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。結(jié)果表明C-CPA痛厭惡模型成功建立。

圖3 CFA誘導(dǎo)的大鼠條件位置逃避反應(yīng)Note.Compared with pre-conditioning day,△△P<0.01.Compared with NSgroup,**P<0.01.Figure 3 CFA-induced conditioned place avoidance response of rats

2.2 各組大鼠PWTs變化情況

如圖4所示,模前第5天,四組大鼠基礎(chǔ)PWTs均無(wú)差異(P>0.05)。造模后第2天,與NS組比較,C-CPA組、EA1組和EA2組大鼠患側(cè)PWTs顯著降低(P<0.01);與C-CPA組比較,EA1組和EA2組大鼠患側(cè)PWTs明顯增加(P<0.01)且兩組間相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。結(jié)果表明造模前后介入電針均可有效緩解C-CPA大鼠的疼痛。

圖4 各組大鼠患側(cè)PWTs變化情況Note.Compared with NSgroup,**P<0.01.Compared with C-CPA group,▲▲P<0.01.Figure 4 Changes of ipsilateral PWTs of rats in each group

2.3 各組大鼠焦慮行為變化情況

采用高架O迷宮觀察大鼠的焦慮行為。如圖5所示,對(duì)于開(kāi)放臂運(yùn)動(dòng)距離,與NS組比,C-CPA組、EA1組、EA2組大鼠均顯著減少(P<0.05);與CCPA組比,EA1組、EA2組均顯著增加(P<0.05);EA1組與EA2組差異不明顯(P>0.05)。對(duì)于開(kāi)放臂停留時(shí)間和開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù),與NS組比,C-CPA組大鼠均顯著減少(P<0.05),EA1組、EA2組差異不明顯(P>0.05);與C-CPA組比,EA1組、EA2組顯著增加(P<0.05);EA1組與EA2組無(wú)顯著差異(P>0.05)。對(duì)于總運(yùn)動(dòng)距離,與NS比,C-CPA組、EA1組和EA2組顯著減少(P<0.05),且后三組組間兩兩比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖5 各組大鼠O迷宮行為學(xué)變化情況Note.The left and right bold boxes are selected as closed arms.Compared with NS group,*P<0.05.Compared with C-CPA group,▲P<0.05.(The same in the following figures)Figure 5 Behavioral changes of elevated zero maze of rats in each group

同時(shí)采用曠場(chǎng)觀察各組大鼠的焦慮行為。如圖6所示,對(duì)于中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間、中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)和總運(yùn)動(dòng)距離,與NS組相比,C-CPA組大鼠均顯著減少(P<0.05),EA1組、EA2組差異不顯著(P>0.05)。與C-CPA組相比,EA1組、EA2組顯著增加(P<0.05)。EA1組與EA2組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果表明不同時(shí)間介入電針均能有效緩解C-CPA大鼠的焦慮行為。

圖6 各組大鼠曠場(chǎng)行為學(xué)變化情況Figure 6 Behavioral changes of open field of rats in each group

2.4 各組大鼠患側(cè)ACC中NMDAR和GABAR總蛋白表達(dá)差異

如圖7A、B所示,與NS組比較,C-CPA組、EA1組和EA2組大鼠患側(cè)ACC腦區(qū)GABAAR總蛋白顯著增加(P<0.05);與C-CPA組比較,EA1組無(wú)顯著性差異(P>0.05),EA2組的GABAAR總蛋白明顯減少(P<0.05);與EA1組比較,EA2組的GABAAR無(wú)顯著性差異(P>0.05)。如圖7C～H所示,各組患側(cè)ACC中GABABR、NR2A、NR2B總蛋白含量組間兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明預(yù)電針提高了C-CPA大鼠患側(cè)ACC腦區(qū)GABAAR蛋白表達(dá),效果優(yōu)于模后電針,對(duì)GABABR、NR2A、NR2B總蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。

圖7 各組大鼠患側(cè)ACC中受體蛋白表達(dá)變化Figure 7 Protein expression changes of receptor in ipsilateral ACC in each group

3 討論

慢性痛產(chǎn)生持久的疼痛記憶難以消除,易表現(xiàn)為厭惡、逃避、焦慮等痛情緒[22]。電針通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)揮鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)情緒等療效[23]。研究報(bào)道預(yù)電針比常規(guī)電針的鎮(zhèn)痛效應(yīng)更顯著[18],同時(shí),預(yù)電針對(duì)長(zhǎng)期應(yīng)激所致的焦慮行為緩解顯著[24]。但相比于常規(guī)電針,預(yù)電針對(duì)于痛情緒的調(diào)節(jié)是否更具優(yōu)勢(shì),其作用機(jī)制與常規(guī)電針是否存在差異,目前尚無(wú)報(bào)道?；诖?采用預(yù)電針和常規(guī)電針干預(yù)痛情緒大鼠,比較并探究療效差異及相關(guān)分子機(jī)制。

目前已有多種痛情緒模型研究其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制,如福爾馬林(formalin)誘導(dǎo)的條件位置回避(formalin-induced conditioned place avoidance,FCPA)痛厭惡模型[14]、足電擊誘導(dǎo)的條件位置回避(electric foot-shock conditioned place avoidance,S-CPA)恐懼模型[25]、利血平(reserpine)誘導(dǎo)痛抑郁大鼠模型[26]。選用足底注射CFA誘導(dǎo)條件位置逃避建立C-CPA痛厭惡模型,其優(yōu)勢(shì)在于足底注射CFA短期即可出現(xiàn)紅腫熱痛等現(xiàn)象[27];相較于福爾馬林,無(wú)吸入毒性,無(wú)臭無(wú)味,避免與肉桂油、醋酸等氣味混雜;而S-CPA模型的條件性位置回避并非疼痛引發(fā),可能更多的與恐懼和電擊不適感相關(guān)[25];另外,相比于利血平誘導(dǎo)的痛抑郁模型[28],C-CPA模型涵蓋焦慮、抑郁、厭惡等多類痛情緒[19,29]。本次實(shí)驗(yàn)中,成功建立C-CPA模型,與馬洋等[30]研究結(jié)果相似。電針緩解CFA所致慢性痛的報(bào)道眾多[31-32],本實(shí)驗(yàn)也觀察到了電針對(duì)C-CPA大鼠具有良好的鎮(zhèn)痛作用,與課題組既往研究結(jié)果[33-34]類似。趙宇等[18]發(fā)現(xiàn)2 h內(nèi)僅進(jìn)行預(yù)電針比模后電針的鎮(zhèn)痛效果更顯著。結(jié)果提示EA1與EA2組電針后PWTs無(wú)明顯差異,以上差異可能與造模方式、測(cè)量時(shí)間不同有關(guān)。

高架O迷宮(EZM)和曠場(chǎng)(OF)是經(jīng)典情緒行為學(xué)檢測(cè)工具,其基于嚙齒類動(dòng)物本能地回避在無(wú)臂保護(hù)的高架與中央空曠地帶活動(dòng),趨向于相對(duì)封閉、狹小的安全區(qū)或角落的特性來(lái)測(cè)量大鼠的焦慮情緒行為[35]。邵芳冰等[34]發(fā)現(xiàn)注射CFA的大鼠在EZM的開(kāi)放臂或OF的中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離、進(jìn)入次數(shù)、停留時(shí)間均減少。佘麗嬌[36]發(fā)現(xiàn)電針治療CFA致痛的大鼠在EZM開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)顯著增加。任澤琴等[37],呂竹青[38]發(fā)現(xiàn)電針顯著改善了抑郁等病態(tài)情緒大鼠在OF中的焦慮行為。Wu等[26]發(fā)現(xiàn)100 Hz電針對(duì)reserpine注射大鼠在EZM、OF中原有的焦慮樣行為有顯著緩解,也觀察到類似的結(jié)果,如電針后C-CPA模型大鼠在EZM開(kāi)放臂和OF中央?yún)^(qū)的運(yùn)動(dòng)距離、停留時(shí)間和進(jìn)入次數(shù)均減少。同時(shí),比較觀察了不同時(shí)期電針干預(yù)對(duì)C-CPA大鼠的焦慮行為差異,結(jié)果提示EA1組和EA2組均能改善C-CPA大鼠的焦慮情緒行為,這與Zhou等[24]發(fā)現(xiàn)預(yù)電針同樣能顯著緩解PTSD大鼠焦慮行為的結(jié)果一致。

前扣帶皮層(ACC)屬于邊緣系統(tǒng),是痛感覺(jué)與痛情感控制的關(guān)鍵皮質(zhì)區(qū)域[25],ACC的過(guò)度興奮與慢性炎性痛和情緒行為的關(guān)系已得到充分證明[14,39-40]。ACC含大量以谷氨酸為代表的興奮性氨基酸和以γ-氨基丁酸為代表的抑制性氨基酸及各自受體[41-42]。這兩種主要的氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的平衡決定了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理穩(wěn)態(tài),防止產(chǎn)生焦慮等病態(tài)情緒[43]。

NMDAR是谷氨酸受體之一[44],其中NR2A、NR2B兩種受體參與疼痛與痛情緒信號(hào)傳遞[45]。如任文華[46]發(fā)現(xiàn)炎性痛等有害刺激可誘導(dǎo)大鼠ACC內(nèi)NR2A和NR2B的表達(dá),激活NR1中的Gly位點(diǎn),通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶-環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白信號(hào)通路形成痛情緒。另有文獻(xiàn)報(bào)道[45],利血平誘導(dǎo)的炎性痛大鼠ACC中NR2A和NR2B的表達(dá)量增加,與特殊的情境(如CPA)搭配時(shí)會(huì)產(chǎn)生痛厭惡情緒。而在CFA誘導(dǎo)的炎性痛小鼠中,僅觀察到ACC水平NR2B的表達(dá)增多,但對(duì)NR2A的表達(dá)不影響[47]。在本次實(shí)驗(yàn)中,觀察到,C-CPA模型大鼠相較于NS組,其ACC中NR2A和NR2B蛋白表達(dá)相較均無(wú)明顯變化。因此,猜測(cè),ACC水平的NR2A和NR2B未參與C-CPA大鼠模型的疼痛和痛情緒的調(diào)節(jié)。已有研究觀察到,電針治療Wistar大鼠腸易激綜合征所致腹痛效佳,且不同穴位的電針都能減少大鼠ACC中NR2A的表達(dá),但對(duì)NR2B的表達(dá)無(wú)明顯效果或表現(xiàn)出減少[48]。EA1組和EA2組大鼠ACC中NR2A和NR2B蛋白表達(dá)相較于C-CPA組,均無(wú)明顯變化,猜測(cè)NR2A和NR2B不參與C-CPA大鼠模型的疼痛和痛情緒的調(diào)節(jié),因此電針干預(yù)對(duì)其表達(dá)也未起到調(diào)節(jié)作用。

GABA是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),其介導(dǎo)突觸前抑制和突觸后抑制效應(yīng)需與神經(jīng)元細(xì)胞膜上GABA受體結(jié)合[49],目前主要有3類GABA受體:GABAAR、GABABR 和 GABACR,其 中GABAAR、GABABR與疼痛、焦慮抑郁等情緒關(guān)系密切[32,50-51]。已有研究觀察到,在神經(jīng)病理痛誘導(dǎo)的痛情緒大鼠模型中,杏仁核內(nèi)GABAAR和GABABR的基因及蛋白表達(dá)減少,電針干預(yù)可上調(diào)兩者的基因及蛋白表達(dá)[52]。在CFA誘導(dǎo)的慢性炎性痛大鼠模型中,可觀察到下丘腦和ACC腦區(qū)GABAAR的mRNA表達(dá)無(wú)顯著變化,且電針干預(yù)對(duì)其表達(dá)無(wú)影響[53]。本次研究觀察到C-CPA大鼠患側(cè)ACC腦區(qū)GABAAR的蛋白表達(dá)顯著增加,GABABR無(wú)顯著變化;EA2組ACC腦區(qū)GABAAR的蛋白表達(dá)減少,EA1組無(wú)明顯變化。因此,認(rèn)為ACC腦區(qū)GABAAR蛋白的高表達(dá)是C-CPA模型疼痛和痛情緒產(chǎn)生的主要原因之一。提前介入電針通過(guò)下調(diào)GABAAR蛋白的高表達(dá)起到鎮(zhèn)痛和抗痛情緒的作用,常規(guī)電針對(duì)C-CPA模型的疼痛和痛情緒的調(diào)控機(jī)制可能與ACC腦區(qū)內(nèi)GABAAR蛋白的表達(dá)無(wú)關(guān),其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上,通過(guò)建立痛厭惡模型,觀察經(jīng)典的疼痛和情緒行為,發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間介入電針干預(yù)均能有效改善痛厭惡模型大鼠的疼痛和焦慮情緒行為。其中預(yù)電針的療效可能與調(diào)控ACC腦區(qū)GABAAR蛋白表達(dá)相關(guān),這可能是電針干預(yù)痛情緒的中樞機(jī)制之一。