黃會(huì)珍,趙洪慶,王宇紅*,張尚霞,金獅,羅薇絮,李姿蓉

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心,長(zhǎng)沙 410208;2.山東省藥學(xué)科學(xué)院,濟(jì)南 250013)

近年來(lái),抑郁癥的發(fā)病率逐年遞增。據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),全球共有約3.5億抑郁癥患者,我國(guó)抑郁癥患病率達(dá)4.2%,每年因抑郁癥而自殺的人數(shù)高達(dá)100萬(wàn)人[1],預(yù)計(jì)到2030年抑郁癥將在全球疾病總負(fù)擔(dān)中排名首位[2]。睡眠障礙是抑郁癥患者中最常見(jiàn)的軀體癥狀,據(jù)調(diào)查90%抑郁癥患者存在睡眠障礙,而其中88%抑郁癥睡眠障礙患者主要表現(xiàn)為失眠[3]。目前關(guān)于抑郁癥失眠的研究大多集中于臨床[4-5],主要是因?yàn)槿狈σ环N穩(wěn)定性高、可實(shí)施性強(qiáng)又能最大限度模擬抑郁癥失眠患者臨床發(fā)病特征的動(dòng)物模型及一套相關(guān)的評(píng)價(jià)體系。目前可以肯定的是生物、心理與社會(huì)環(huán)境等諸多因素參與了抑郁癥失眠的發(fā)病過(guò)程,且這些因素并不是單獨(dú)起作用的,而是各因素聯(lián)合作用導(dǎo)致疾病的發(fā)生[6]。所以復(fù)合模型比單純的軀體應(yīng)激或藥物刺激更能模擬該病的臨床表征。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建一種最佳的慢性應(yīng)激聯(lián)合睡眠剝奪的方法,為抑郁癥失眠的實(shí)驗(yàn)研究提供一種相對(duì)可靠的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

84只6～7周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠,體重180～200 g,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作有限公司【SCXK(湘)2016-0002】。實(shí)驗(yàn)單位為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房【SYXK(湘)2020-0010】。研究?jī)?nèi)容和過(guò)程涉及的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作均符合國(guó)家對(duì)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的有關(guān)要求(倫理批準(zhǔn)編號(hào):HN-LL-KY-2019-012-01)。實(shí)驗(yàn)條件為:室溫(25±2)℃、房間相對(duì)濕度(50%±5%)、保持12 h/12 h光暗周期,動(dòng)物可自由攝取食物與水。

1.1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉(69020183,國(guó)藥集團(tuán))、CORT、ACTH、CRH、Glu、GABA酶聯(lián)免疫試劑盒均購(gòu)自上海晶天生物科技有限公司、NE(B24713)、DA(B25300)、5-HT(B21833)對(duì)照品均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司、生理、藥理電子刺激儀(YLS-9A型,濟(jì)南益延科技)、高效液相色譜儀(1260型,Aglient)、ECD電化學(xué)檢測(cè)器(Antec)、生物組織包埋機(jī)(BM-Ⅷ型,湖北孝感宏業(yè))、石蠟切片機(jī)(HM325型,Thermo Scientific)、酶標(biāo)儀(MK3型,Thermo Scientific)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組、造模

適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后將所有大鼠按體重隨機(jī)分為7組,慢性不可預(yù)見(jiàn)性中度應(yīng)激組(chronic unpredictable middle stress,CUMS)、72 h睡眠剝奪組(72 h sleep deprivation,72 h SD)、慢性不可預(yù)見(jiàn)性中度應(yīng)激+72 h睡眠剝奪組(CUMS+72 h SD)、21 d睡眠剝奪組(21 d SD)、慢性不可預(yù)見(jiàn)性中度應(yīng)激+21 d睡眠剝奪組(CUMS+21 d SD),另設(shè)空白組、環(huán)境對(duì)照組,每組12只。造模前14 d為CUMS造模,CUMS具體方法為:動(dòng)物實(shí)行孤籠飼養(yǎng),應(yīng)激方法包括禁食24 h、4℃冰水4 min、傾籠45℃+噪音4 h、潮濕墊料+晝夜顛倒24 h、電壓70 V,電流強(qiáng)度2 mA,間斷持續(xù)1 min的足底電擊、禁水24 h、夾尾1 min。每天1種刺激,7種刺激不重復(fù)出現(xiàn)[7-8]。15～35 d為SD造模,采用改良多平臺(tái)水環(huán)境法對(duì)大鼠進(jìn)行快速眼動(dòng)睡眠剝奪,睡眠剝奪箱為本課題組自制玻璃箱體,箱內(nèi)置若干個(gè)連體不銹鋼平臺(tái),其直徑為6.5 cm,高為10 cm,注水至平臺(tái)下方1 cm。平臺(tái)上的大鼠進(jìn)入快波睡眠時(shí)全身肌張力下降,身體接觸到水面而不能完全入睡,達(dá)到睡眠剝奪的目的。環(huán)境對(duì)照組箱內(nèi)放置一鐵絲網(wǎng),大鼠可在上面自由活動(dòng)。所有大鼠均可自行飲水和攝食。21 d SD組每天15:00至隔天9:00進(jìn)行18 h SD[9],連續(xù)21 d;72 h SD組于造模最后3 d進(jìn)行連續(xù)72 h SD[10];復(fù)合模型組在進(jìn)行失眠造模期間均不間斷抑郁造模。分別于應(yīng)激造模14 d后和復(fù)合造模結(jié)束后對(duì)各組部分大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè),取各大鼠血液、腦區(qū)進(jìn)行多方面指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2 動(dòng)物行為學(xué)檢測(cè)

(1)體重變化情況:體重變化率(%)=(第7、14、21、28、35天的體重-第1天的體重)/第1天的體重。

(2)攝食量變化情況:每周對(duì)各組大鼠進(jìn)行1次攝食統(tǒng)計(jì)。

(3)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn):將大鼠從敞箱底面中央一格放入,適應(yīng)30 s,記錄4 min內(nèi)大鼠水平活動(dòng)次數(shù)、垂直站立次數(shù)和糞便粒數(shù)。

(4)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn):將大鼠放入水缸中計(jì)時(shí)30 s使其適應(yīng),記錄4 min內(nèi)大鼠的不動(dòng)時(shí)間。大鼠僅留鼻孔露出水面呼吸呈自然漂浮狀態(tài)即記為游泳不動(dòng)時(shí)間。

(5)糖水消耗實(shí)驗(yàn):禁食禁水24 h,每只大鼠放置1瓶1%的蔗糖水和1瓶蒸餾水,1 h后調(diào)換水瓶位置,計(jì)算2 h內(nèi)蔗糖水消耗量,糖水消耗率(%)=蔗糖水總消耗量/(蔗糖水總消耗量+蒸餾水總消耗量)×100%。

(6)戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn):經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)得出大鼠戊巴比妥鈉閾上劑量為35 mg/kg。禁食不禁水12 h,腹腔注射,記錄以下數(shù)據(jù):①注射戊巴比妥鈉的時(shí)間。②入睡時(shí)間:大鼠背向下姿勢(shì)保持30 s以上,并且1 min內(nèi)不出現(xiàn)翻正反射。③覺(jué)醒時(shí)間:大鼠自動(dòng)翻轉(zhuǎn)至背向上姿勢(shì)且保持30 s以上,認(rèn)為其翻正反射恢復(fù)。計(jì)算入睡潛伏期和睡眠時(shí)長(zhǎng)。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清中HPA軸指標(biāo)和下丘腦中Glu、GABA含量

收集血液于不含添加劑的采血管中,3500 r/min,10 min離心取上清液即為血清樣本。大鼠下丘腦按質(zhì)量體積比1:20比例加入磷酸緩沖鹽溶液,冰上勻漿。4℃、12 000 r/min離心10 min后取上清液。根據(jù)試劑盒中的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度與其對(duì)應(yīng)的校正OD值作出線性回歸方程,將樣品的OD值代入回歸方程中計(jì)算出每個(gè)樣品濃度。

1.2.4 HPLC-ECD檢測(cè)大鼠下丘腦中單胺遞質(zhì)含量

取冷凍保存的下丘腦,精密稱(chēng)重,按質(zhì)量體積比為1∶3加入0.01 mol/L高氯酸溶液,冰上勻漿,4℃、13 000 r/min離心10 min后取上清液,0.22 μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾,進(jìn)樣。色譜條件為:色譜柱:Quattro 4 C18柱;流動(dòng)相:磷酸二氫鈉/檸檬酸混合液-甲醇(90∶10);流速:0.3 mL/min;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:20μL。精密稱(chēng)取適量對(duì)照品溶于0.01 mol/L高氯酸溶液中,配成1 mg/mL儲(chǔ)備液,依次稀釋成7個(gè)濃度點(diǎn),根據(jù)各峰面積計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)表1)。

表1 單胺遞質(zhì)對(duì)照品的回歸方程和濃度梯度Table 1 Regression equation and concentration gradient of monoamine transmitter control

1.2.5 HE染色觀察下丘腦-海馬組織病理狀態(tài)

取4%多聚甲醛固定好的下丘腦組織,進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋,4μm切片后進(jìn)行以下步驟。脫蠟、水化、染色、脫水、封片,玻片晾干后,即可觀察下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用One-Way ANOVA分析,滿(mǎn)足方差齊性采用LSD檢驗(yàn);方差不齊時(shí)選擇Dunnett’s T3檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每周1次的體重增長(zhǎng)率和攝食量統(tǒng)計(jì)為重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù),需用重復(fù)測(cè)量資料方差分析進(jìn)行Mauchly球形檢驗(yàn),P>0.05即符合球形對(duì)稱(chēng)Huynh-Feldt條件,采用One-Way ANOVA分析;若P<0.05,說(shuō)明不符合Huynh-Feldt條件,需對(duì)組內(nèi)效應(yīng)進(jìn)行校正,選用多元方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重增長(zhǎng)率變化

與空白組比較,各模型組中尤以CUMS+21 d SD組大鼠體重增長(zhǎng)率下降明顯;后期與CUMS+72 h組相比,CUMS+21 d SD組大鼠的體重增長(zhǎng)率是顯著下降的(P<0.01)(見(jiàn)圖1)。

圖1 各組大鼠體重增長(zhǎng)率比較(±s,n=10)Note.Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01.Compared with CUMS group,▲P<0.05,▲▲P<0.01.Compared with CUMS+72 h SD group,#P<0.05,##P<0.01.(The same in the following figures and tables)Figure 1 Comparison of body weight growth rate of rats in each group(±s,n=10)

2.2 大鼠攝食量變化

與空白組相比,各模型組大鼠攝食量均呈逐漸減少的趨勢(shì)(P<0.05或P<0.01);與CUMS+72 h組相比,造模結(jié)束后CUMS+21 d SD組大鼠的攝食量是顯著減少的(P<0.01)(見(jiàn)表2)。

表2 造模期間大鼠平均每天攝食情況(±s,n=10)Table 2 Average daily intake of rats(±s,n=10)

表2 造模期間大鼠平均每天攝食情況(±s,n=10)Table 2 Average daily intake of rats(±s,n=10)

組別Groups 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d空白組Control group 23.04±0.86 25.65±1.46 29.74±1.83 30.69±0.53 30.29±0.69環(huán)境對(duì)照組Environental control group 22.99±0.57 24.49±0.81 28.99±0.77 29.98±2.81 29.64±1.17 CUMS組CUMSgroup 21.33±1.45* 21.20±0.27** 21.66±1.98** 20.33±1.29** 19.07±0.32**72 h SD組72 h SD group 22.75±0.70 25.10±0.99 29.48±1.13 29.78±0.42 24.44±1.24**CUMS+72 h SD組CUMS+72 h SD group 21.50±0.20* 22.15±1.20** 21.56±2.50** 21.42±0.39** 17.71±0.75**21 d SD組21 d SD group 22.89±0.45 25.73±0.57 18.93±0.40** 18.19±0.14** 17.99±0.27**CUMS+21 d SD組CUMS+21 d SD group 21.80±0.51 22.11±0.91** 17.88±0.44**▲▲## 17.65±0.18**▲## 15.98±0.51**▲▲#F 2.872 11.805 36.125 71.487 169.083 P 0.049 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 CUMS造模14 d和復(fù)合造模結(jié)束各行為學(xué)結(jié)果

2.3.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

與空白組相比,CUMS造模兩周后,經(jīng)過(guò)應(yīng)激的各組大鼠均表現(xiàn)出了自主活動(dòng)降低的趨勢(shì),糞便粒數(shù)增多。與CUMS+72 h SD組比,CUMS+21 d SD組大鼠的水平活動(dòng)次數(shù)下降,站立次數(shù)明顯減少(P<0.05),糞便粒數(shù)顯著增加(P<0.05)(見(jiàn)圖2)。

圖2 各組大鼠結(jié)束曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=8)Figure 2 Open field test results of rats in each group(±s,n=8)

2.3.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

與空白組比,經(jīng)過(guò)CUMS造模的模型組大鼠不動(dòng)時(shí)間明顯增加(P<0.05),復(fù)合造模結(jié)束后,CUMS+21 d SD組大鼠不動(dòng)時(shí)間明顯較長(zhǎng)(見(jiàn)表3)。

表3 各組大鼠強(qiáng)迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=8)Table 3 Force swimming test results of rats in each group(±s,n=8)

表3 各組大鼠強(qiáng)迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=8)Table 3 Force swimming test results of rats in each group(±s,n=8)

組別Groups 14 d不動(dòng)時(shí)間14 d immobility time造模結(jié)束不動(dòng)時(shí)間Immobility time at the end of modeling空白組Control group 1.67±1.64 6.68±3.52環(huán)境對(duì)照組Environental control group 1.60±0.80 6.45±2.04 CUMS組CUMSgroup 3.63±3.38* 14.17±6.81*72 h SD組72 h SD group 1.55±1.26 8.01±4.01 CUMS+72 h SD組CUMS+72 h SD group 3.54±2.28* 12.14±6.70*21 d SD組21 d SD group 2.90±2.65 13.54±6.28*CUMS+21 d SD組CUMS+21 d SD group 3.66±2.62* 18.31±12.50**F 1.613 3.469 P 0.164 0.006

2.3.3 糖水消耗實(shí)驗(yàn)

與空白組相比,經(jīng)過(guò)14 d CUMS,各造模組的平均糖水消耗率顯著下降(P<0.01);復(fù)合造模結(jié)束后,與CUMS+72 h SD組相比,CUMS+21 d SD組大鼠的糖水消耗率明顯下降(P<0.05)。與上述兩個(gè)行為學(xué)結(jié)果一致(見(jiàn)表4)。

表4 各組大鼠糖水消耗實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=12)Table 4 Sugar water consumption test results of rats in each group(±s,n=12)

表4 各組大鼠糖水消耗實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=12)Table 4 Sugar water consumption test results of rats in each group(±s,n=12)

組別Groups 14 d糖水消耗率14 d sugar consumption rate造模結(jié)束糖水消耗率Sugar consumption rate at the end of modeling空白組Control group 67.91±16.61 69.82±14.52環(huán)境對(duì)照組Environental control group 64.23±11.56 73.80±15.24 CUMS組CUMSgroup 41.19±11.88** 39.69±13.52**72 h SD組72 h SD group 68.14±11.94 60.97±20.59 CUMS+72 h SD組CUMS+72 h SD group 40.63±15.61** 51.20±15.24**21 d SD組21 d SD group 66.18±9.15 50.92±17.30**CUMS+21 d SD組CUMS+21 d SD group 42.69±14.14** 35.72±11.40**#F 10.857 9.654 P 0.000 0.000

2.3.4 戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn)

與空白組相比,各模型組大鼠睡眠潛伏期顯著增長(zhǎng)(P<0.05或P<0.01),睡眠時(shí)長(zhǎng)明顯縮短(P<0.01);與CUMS+72 h SD組相比,CUMS+21 d SD組大鼠表現(xiàn)雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但睡眠潛伏期有所增加,睡眠時(shí)長(zhǎng)有所減少(見(jiàn)表5)。

表5 造模結(jié)束翻正實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=10)Table 5 Experimental results of righting at the end of modeling(±s,n=10)

表5 造模結(jié)束翻正實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s,n=10)Table 5 Experimental results of righting at the end of modeling(±s,n=10)

組別Groups 睡眠潛伏期Sleep latency 睡眠時(shí)長(zhǎng)Sleep duration空白組Control group 6.30±1.42 111.50±47.09環(huán)境對(duì)照組Environental control group 6.44±1.67 95.56±18.40 CUMS組CUMSgroup 8.50±4.06 64.42±16.00**72 h SD組72 h SD group 11.10±10.42 89.30±29.97 CUMS+72 h SD組CUMS+72 h SD group 13.92±8.74* 61.08±24.90**21 d SD組21 d SD group 15.40±9.05** 58.60±26.29**CUMS+21 d SD組CUMS+21 d SD group 16.42±8.38**▲▲ 51.58±26.50**F 3.580 6.692 P 0.004 0.000

2.4 ELISA測(cè)定血清中HPA軸各指標(biāo)和下丘腦中Glu、GABA含量

2.4.1 血清中HPA軸各指標(biāo)含量

與空白組相比,CUMS+21 d SD組大鼠血清中各指標(biāo)含量升高最明顯(P<0.01);與CUMS+72 h SD組相比,CUMS+21 d SD組三個(gè)指標(biāo)含量均顯著增加(P<0.05或P<0.01)(見(jiàn)表6)。

表6 各組大鼠血清CRH、ACTH、CORT含量變化(±s,n=6)Table 6 Changes of CRH,ACTH and CORT in serum of rats in each group(±s,n=6)

表6 各組大鼠血清CRH、ACTH、CORT含量變化(±s,n=6)Table 6 Changes of CRH,ACTH and CORT in serum of rats in each group(±s,n=6)

組別Groups CRH(ng/mL) ACTH(ng/L) CORT(ng/mL)空白組Control group 3.27±0.18 26.66±3.59 6.37±0.32環(huán)境對(duì)照組Environental control group 3.28±0.17 28.46±3.78 5.52±0.26 CUMS組CUMSgroup 3.56±0.14* 35.28±5.76* 7.54±0.35*72 h SD組72 h SD group 2.87±0.12* 32.66±2.83 6.58±0.75 CUMS+72 h SD組CUMS+72 h SD group 3.63±0.20* 35.27±4.30* 7.58±1.33*21 d SD組21 d SD group 3.63±0.34* 33.79±2.04 7.73±0.36*CUMS+21 d SD組CUMS+21 d SD group 4.56±0.14**▲▲## 48.60±2.90**▲▲## 9.04±0.13**▲#F 21.161 11.688 9.918 P 0.000 0.000 0.000

2.4.2 下丘腦中Glu、GABA含量

與空白組相比,各模型組大鼠下丘腦Glu含量上升,GABA含量下降(P<0.05或P<0.01),與CUMS+72 h SD組比較,CUMS+21 d SD組Glu和GABA含量均有明顯變化(見(jiàn)表7)。

表7 各組大鼠下丘腦Glu、GABA含量變化(±s,n=3)Table 7 Changes of Glu and GABA contents in hypothalamus of rats in each group(±s,n=3)

表7 各組大鼠下丘腦Glu、GABA含量變化(±s,n=3)Table 7 Changes of Glu and GABA contents in hypothalamus of rats in each group(±s,n=3)

組別Groups Glu(nmol/mL) GABA(nmol/L)空白組Control group 6918.62±106.19 5682.22±144.94環(huán)境對(duì)照組Environental control group 6986.98±247.27 5617.50±121.60 CUMS組CUMSgroup 7373.52±467.17 5090.00±106.77**72 h SD組72 h SD group 7298.85±89.48 5364.80±187.62*CUMS+72 h SD組CUMS+72 h SD group 7866.22±47.63**▲ 5005.10±144.65**21 d SD組21 d SD group 8007.98±257.98** 5315.47±50.59**CUMS+21 d SD組CUMS+21 d SD group 8690.24±519.04**▲▲## 4316.00±210.23**▲▲##F 13.230 29.824 P 0.000 0.000

2.5 HPLC-ECD法測(cè)定大鼠下丘腦單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量

與空白對(duì)照組比,各模型組大鼠下丘腦中三種單胺遞質(zhì)含量均明顯下降(P<0.05或P<0.01);與CUMS+72 h SD組比,CUMS+21 d SD組三種單胺遞質(zhì)含量明顯減少(P<0.01)(見(jiàn)圖3)。

圖3 各組大鼠下丘腦單胺遞質(zhì)含量變化(±s,n=3)Figure 3 Changes of monoamine transmitters in hypothalamus of rats in each group(±s,n=3)

2.6 HE染色觀察下丘腦組織病理狀態(tài)

空白對(duì)照組大鼠下丘腦細(xì)胞大小均勻,排列有序,細(xì)胞無(wú)空泡樣現(xiàn)象;CUMS+72 h SD和CUMS+21 d SD兩個(gè)復(fù)合模型組下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重,后者更為明顯,細(xì)胞排列紊亂、間隙變大,空泡樣性狀顯著(見(jiàn)圖4)。

圖4 各組大鼠下丘腦HE染色結(jié)果Figure 4 HE staining results of hypothalamus in each group

3 討論

目前,關(guān)于抑郁癥失眠大鼠模型的建立大致分為兩種方法:一種是僅對(duì)動(dòng)物進(jìn)行抑郁癥造模處理,認(rèn)為抑郁癥能夠自發(fā)產(chǎn)生失眠,失眠是抑郁癥發(fā)病的一種癥狀。通常在抑郁癥造模期間進(jìn)行腦電圖監(jiān)測(cè)睡眠情況,沒(méi)有進(jìn)行復(fù)合造模[11-12]。另一種是復(fù)合因子造模方法,通常采用慢性應(yīng)激先建立抑郁癥模型,后采用72 h睡眠剝奪建立失眠模型,認(rèn)為抑郁癥狀態(tài)下不可能有100%的概率自發(fā)產(chǎn)生失眠,單一的造模方法無(wú)法完全模擬抑郁癥失眠特征[13-14]。本實(shí)驗(yàn)在前人基礎(chǔ)上同時(shí)設(shè)置快速和慢性睡眠剝奪兩種方法,進(jìn)行對(duì)比,選出能最大限度模擬臨床發(fā)病特點(diǎn)的模型。

SD大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)與人類(lèi)相似,廣泛用于獎(jiǎng)賞機(jī)制、認(rèn)知記憶等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)的研究,且其垂體-腎上腺系統(tǒng)功能發(fā)達(dá)[15],常用作應(yīng)激反應(yīng)和腎上腺、垂體的反饋調(diào)節(jié)研究[16]。另外,此種屬還具有獲取簡(jiǎn)便、模擬率高、敏感度強(qiáng)及重復(fù)性好等特點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)分別于抑郁造模14 d后和復(fù)合造模結(jié)束后對(duì)各組大鼠進(jìn)行了行為學(xué)評(píng)價(jià),目的是保證復(fù)合模型大鼠在抑郁狀態(tài)前提下進(jìn)行的失眠造模。結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)14 d的應(yīng)激造模,CUMS+21 d SD組大鼠的各行為學(xué)已顯示出抑郁樣趨勢(shì);造模結(jié)束后,對(duì)比兩個(gè)復(fù)合模型組,CUMS+21 d SD組大鼠表現(xiàn)精神萎靡、空間探索主動(dòng)性降低、緊張恐懼心理增加。同樣地,強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和糖水消耗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的應(yīng)激和慢性持續(xù)性的睡眠剝奪可大大增加大鼠的絕望程度,降低求生欲望,使得大鼠快感缺失嚴(yán)重,獎(jiǎng)賞行為減少。

戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CUMS組大鼠睡眠潛伏期增長(zhǎng),睡眠時(shí)長(zhǎng)顯著縮短,說(shuō)明抑郁癥本身具有誘發(fā)失眠的傾向,但復(fù)合模型組比單純抑郁癥組的睡眠潛伏期更長(zhǎng),睡眠時(shí)長(zhǎng)更短,進(jìn)一步體現(xiàn)出復(fù)合因子造模的優(yōu)勢(shì)。且通過(guò)對(duì)比兩個(gè)復(fù)合模型組,CUMS+21 d SD組大鼠的睡眠潛伏期有所增加,睡眠時(shí)長(zhǎng)有所減少,進(jìn)一步說(shuō)明使用慢性應(yīng)激聯(lián)合長(zhǎng)期睡眠剝奪復(fù)制抑郁癥失眠模型成功率更高,穩(wěn)定性更強(qiáng)。

下丘腦與垂體-腎上腺組成的HPA軸被稱(chēng)為是內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的中心[17],HPA軸的活性中樞驅(qū)動(dòng)因子CRH主要是由下丘腦室旁核分泌,故實(shí)驗(yàn)選擇下丘腦作為關(guān)鍵區(qū)域。長(zhǎng)期慢性應(yīng)激狀態(tài)下,CRH過(guò)度分泌,負(fù)反饋調(diào)節(jié)失靈,ACTH、CORT濃度顯著增加,過(guò)多的CORT與其相應(yīng)受體結(jié)合異常刺激CRH的分泌,這種惡性循環(huán)使得CORT一直處于高濃度狀態(tài),引發(fā)抑郁癥慢性失眠[18]。同時(shí),GABA對(duì)室旁核中的CRH神經(jīng)元有抑制作用[19],HPA軸異?；罨瘜?dǎo)致腦內(nèi)Glu濃度明顯上升,神經(jīng)元興奮性毒性增加,加重上述惡性循環(huán),削弱下丘腦功能[20],這可能是抑郁癥失眠的發(fā)病機(jī)制。另外,腦內(nèi)單胺遞質(zhì)的含量常常作為評(píng)價(jià)抑郁模型的重要指標(biāo),許多研究表明單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)與失眠的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),對(duì)于睡眠-覺(jué)醒節(jié)律的調(diào)節(jié)具有重要意義[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CUMS+21 d SD組大鼠相比于其他模型組大鼠血清中HPA軸指標(biāo)水平較高,下丘腦中Glu含量增加、GABA含量減少、三種單胺遞質(zhì)水平降低。

綜上所述,采用慢性不可預(yù)見(jiàn)性中度應(yīng)激聯(lián)合21 d睡眠剝奪的方法可以穩(wěn)定復(fù)制抑郁癥失眠大鼠模型,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展提供了一定的實(shí)踐依據(jù)。