王 姍， 沈永寶， 鮑華鵬， 何洪宇

(1. 南京林業(yè)大學(xué)： a. 林學(xué)院， b. 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心， c. 國家林業(yè)和草原局南方林木種子檢驗中心， 江蘇 南京 210037； 2. 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 江蘇現(xiàn)代園藝工程技術(shù)中心， 江蘇 鎮(zhèn)江 212400)

寶華玉蘭〔Yulaniazenii(W. C. Cheng) D. L. Fu〕為木蘭科(Magnoliaceae)落葉喬木，是中國特有植物。寶華玉蘭觀賞價值極高，并具有較高的藥用價值[1-2]。寶華玉蘭天然種群分布區(qū)域狹小，僅分布于江蘇省鎮(zhèn)江市句容市寶華山海拔220 m的丘陵山地，加之生境被人為破壞，其野生植株數(shù)量稀少[3]，為極危種[4]。

植物有性生殖過程的任一環(huán)節(jié)都非常重要，某個環(huán)節(jié)發(fā)生異常，都可能帶來生殖過程的失敗，而生殖受限則直接導(dǎo)致自我更新困難[5]，最終引發(fā)物種瀕危。全球木蘭科中約50%以上的種類受到嚴重威脅[6]，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注木蘭科植物的分布狀況，并致力于其瀕危機制的研究[7-8]。木蘭科植物生殖發(fā)育過程中的異常往往是導(dǎo)致其瀕危的關(guān)鍵因子之一[9]。生殖發(fā)育異常發(fā)生在受精前和受精后，而木蘭科等原始被子植物的生殖異?，F(xiàn)象主要集中于受精前生殖細胞的發(fā)育異常，涉及大小孢子發(fā)生和雌雄配子體發(fā)育過程[10]。對香木蓮(ManglietiaaromaticaDandy)[11]、紅花木蓮〔Manglietiainsignis(Wall.) Blume〕[12]和鵝掌楸〔Liriodendronchinense(Hemsl.) Sarg.〕[13]的雌雄配子體發(fā)育過程以及煥鏞木〔Woonyoungiaseptentrionalis(Dandy) Y. W. Law〕[14]、深山含笑(MicheliamaudiaeDunn)[15]和觀光木〔Micheliaodora(Chun) Nooteboom et B. L. Chen〕[16]等木蘭科植物的小孢子發(fā)生和花藥發(fā)育過程的研究結(jié)果表明：在雌雄配子體發(fā)育過程中，木蘭科多數(shù)屬的種類存在發(fā)育異?，F(xiàn)象，導(dǎo)致各種敗育現(xiàn)象的發(fā)生，進而影響木蘭科植物生殖的有效性。

對寶華玉蘭的研究主要集中于自然分布現(xiàn)狀[17]、瀕危狀況[18]、群落分布特征[19]、遺傳多樣性[20]和藥用價值[21]等方面。植物致瀕是多方面因子綜合影響的結(jié)果，需對各因子及其作用機制進行深入研究，才能找出導(dǎo)致物種瀕危的主要因子[22]。由于生殖過程中任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都會導(dǎo)致生殖失敗，最終導(dǎo)致植物瀕危，因此，對有性生殖過程進行研究對于揭示瀕危植物的瀕危機制、緩解其瀕危狀態(tài)和制定保護措施均有重要意義。

作者采用石蠟切片法對寶華玉蘭大小孢子發(fā)生及雌雄配子體發(fā)育過程中解剖結(jié)構(gòu)進行觀察，探究發(fā)育異?，F(xiàn)象是否存在，并從生殖生物學(xué)角度分析其生殖發(fā)育特點，探討寶華玉蘭結(jié)籽率低的致因，為其瀕危機制研究及合理保護措施制定奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試寶華玉蘭種植于句容市江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院禾木農(nóng)博園內(nèi)，地理坐標(biāo)為東經(jīng)119°09′58″、北緯31°57′50″；屬于北亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，水熱充沛，全年降水量961.0 mm，年平均氣溫15.4 ℃；地帶性土壤為黃棕壤，土層較厚，適宜亞熱帶植物生長。

1.2 方法

1.2.1 花芽采集 從2018年8月1日至2019年1月31日，每隔15 d采1次花芽；從2019年2月1日至4月30日，每隔3 d采1次花蕾(雄蕊脫落后采集雌蕊柱)。每次采集10枚，立即用FAA固定液〔V(體積分數(shù)50%乙醇)∶V(乙酸)∶V(體積分數(shù)38%甲醛)=90∶5∶5〕固定，并于4 ℃下保存、備用。

1.2.2 石蠟切片制作 采用石蠟切片法[23]制片，取固定處理的花芽或雌蕊柱，橫切花芽或雌蕊柱中部，依次用體積分數(shù)75%、85%、90%和95%乙醇以及無水乙醇進行梯度脫水；然后依次過V(乙醇)∶V(二甲苯)=1∶1的溶液1次、二甲苯2次進行透明，石蠟浸蠟并包埋，用石蠟切片機對包埋塊進行橫切，切片厚度5 μm；切片依次經(jīng)展片、脫蠟、復(fù)水等一系列處理后用番紅-固綠染色，中性樹膠封片。

用Olympus BX43F顯微鏡(日本Olympus公司)進行觀察，并用CaseViewer掃描軟件進行圖像采集。每個時期制作30個切片，每次觀察10個切片，每個切片觀察30個視野。

2 結(jié)果和分析

2.1 小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育過程中解剖結(jié)構(gòu)的變化

寶華玉蘭小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育過程中解剖結(jié)構(gòu)的變化見圖版Ⅰ。

2.1.1 雄蕊和花藥的結(jié)構(gòu) 觀察結(jié)果顯示：寶華玉蘭有雄蕊64～72個，離生，從下至上螺旋狀排列(圖版Ⅰ-1)。每個花藥具4個花粉囊，兩兩排列在花藥兩側(cè)，同一個花藥中花粉囊發(fā)育不同步(圖版Ⅰ-2)。

2.1.2 小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育 觀察結(jié)果表明：寶華玉蘭的小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育從8月上旬開始，至翌年3月上旬結(jié)束，期間的解剖結(jié)構(gòu)發(fā)生如下變化：

8月上旬，為花藥發(fā)育早期，花藥結(jié)構(gòu)簡單，最外面為1層表皮，表皮內(nèi)為1團分生組織(圖版Ⅰ-3)；隨著分生組織細胞的不斷分化，在花藥4個角隅處的表皮下出現(xiàn)孢原細胞，其體積較其他細胞大且具有明顯的細胞核，細胞質(zhì)較濃(圖版Ⅰ-4)。

9月上旬，孢原細胞完成1次平周分裂，形成2層細胞；外層是初生周緣細胞，內(nèi)層是體積較大的初生造孢細胞(圖版Ⅰ-5)。

10月上旬，初生周緣細胞再進行1次平周分裂，形成2層次生周緣細胞；外層細胞逐漸發(fā)育為1層藥室內(nèi)壁(即纖維層)，內(nèi)層細胞繼續(xù)進行平周分裂，形成2或3層中層以及1或2層絨氈層(圖版Ⅰ-6)。與此同時，初生造孢細胞經(jīng)過有絲分裂，形成次生造孢細胞(圖版Ⅰ-7)；絨氈層細胞的細胞質(zhì)濃厚，發(fā)育初期多呈單核(圖版Ⅰ-8)。

11月上旬，進入小孢子母細胞發(fā)育早期，小孢子母細胞體積大、核大而圓、細胞質(zhì)濃厚(圖版Ⅰ-9)；絨氈層細胞也較為活躍，多呈雙核(圖版Ⅰ-10)。

12月下旬，絨氈層細胞邊緣不清晰，開始降解，逐漸形成藥室。小孢子母細胞經(jīng)過第1次減數(shù)分裂形成二分體(圖版Ⅰ-11)，經(jīng)過第2次減數(shù)分裂形成四分體(圖版Ⅰ-12)，同時觀察到四分體小孢子發(fā)生不同程度的收縮變形；同一花粉囊中的四分體具有不同的排列方式，包括四面體型、左右對稱型和“T”型3類，形成的四分體外部包裹著1層胼胝質(zhì)(圖版Ⅰ-13)；隨著胼胝質(zhì)壁溶解消失，小孢子釋放到藥室中，剛釋放出來的小孢子呈不規(guī)則三角形或腎形(圖版Ⅰ-14)。

翌年1月下旬，一部分小孢子由收縮狀態(tài)逐漸擴張，細胞壁慢慢變厚，細胞核游離到細胞壁邊并再次進行有絲分裂(圖版Ⅰ-15)；另一部分小孢子沒有擴張，出現(xiàn)停止發(fā)育的異?，F(xiàn)象。正常發(fā)育的小孢子逐漸變?yōu)榍驙?，細胞核位于細胞中間，進入單核居中期(圖版Ⅰ-16)；隨后細胞核逐漸轉(zhuǎn)移到細胞壁邊，進入單核靠邊期，這2個時期均能觀察到很多停止發(fā)育的小孢子(圖版Ⅰ-17)。進入單核花粉期后，絨氈層細胞逐漸解體，細胞質(zhì)多聚集成團狀(圖版Ⅰ-18)；細胞核繼續(xù)進行1次有絲分裂，形成1個體積較大的營養(yǎng)核和1個體積較小的生殖核；細胞質(zhì)則分裂為2個部分，形成2個細胞(圖版Ⅰ-19)，其中含少量細胞質(zhì)的梭狀生殖核緊貼于細胞壁(圖版Ⅰ-20)。

翌年2月下旬，隨著小孢子繼續(xù)發(fā)育，生殖細胞逐漸脫離花粉內(nèi)壁，游離于細胞質(zhì)中間，形成完整的成熟二細胞型花粉。該時期也觀察到異常發(fā)育的花粉(圖版Ⅰ-21)。

翌年3月上旬，進入開花期，絨氈層和中層消失，藥室內(nèi)壁細胞徑向延長并呈帶狀加厚；相鄰的小孢子囊藥室壁逐漸打開，花粉散出(圖版Ⅰ-22)。另外，300個花粉囊的統(tǒng)計結(jié)果顯示：寶華玉蘭的花粉敗育率達到61.3%。

2.2 大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育過程中解剖結(jié)構(gòu)的變化

寶華玉蘭大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育過程中解剖結(jié)構(gòu)的變化見圖版Ⅱ。

2.2.1 雌蕊的結(jié)構(gòu) 觀察結(jié)果顯示：寶華玉蘭雌蕊由146～150個淺紫色離生的心皮組成，由下至上螺旋狀排列；雌蕊原基基部卷合，心皮腹面細胞快速分裂，向上產(chǎn)生小突起，形成一團突起的組織，即胚珠原基。每個心皮含胚珠2個，胚珠倒生、雙珠被、厚珠心、邊緣胎座。成熟期柱頭頂端有鋸齒狀突起，向外彎曲。

2.2.2 大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育 觀察結(jié)果表明：寶華玉蘭的大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育均晚于其小孢子和雄蕊，從12月中下旬開始，至翌年4月上旬結(jié)束，期間的解剖結(jié)構(gòu)發(fā)生如下變化：

12月中下旬，花芽的胚珠原基開始突起(圖版Ⅱ-1)。

翌年1月中下旬，胚珠原基繼續(xù)突出呈指形(圖版Ⅱ-2)，但同一朵花不同雌蕊以及同一子房內(nèi)的胚珠發(fā)育不同步(圖版Ⅱ-3)。

翌年2月上旬，在胚珠珠孔端的表皮下分化出孢原細胞，經(jīng)過數(shù)次垂周和平周分裂形成2～4層細胞；隨孢原細胞的發(fā)育，內(nèi)外珠被開始發(fā)育并逐漸包圍珠心，整個胚珠倒生；每個胚珠原基內(nèi)的珠心組織中間產(chǎn)生1個大孢子母細胞(圖版Ⅱ-4)。

翌年3月上旬，進入盛花期，能觀察到少量具剛發(fā)育出內(nèi)外珠被的胚珠，大部分呈指形突起(圖版Ⅱ-5)。

翌年3月中旬，花瓣與雄蕊脫落，能觀察到較多的具內(nèi)外珠被的胚珠且內(nèi)外珠被尚未發(fā)育完全，此時大孢子母細胞具有明顯的細胞核，生理活動旺盛。此時的胚珠內(nèi)外珠被明顯，大孢子母細胞減數(shù)分裂1次后形成了二分體；二分體細胞繼續(xù)進行減數(shù)分裂，形成直線型大孢子四分體(圖版Ⅱ-6)；其中3個大孢子退化消失，只有合點端的大孢子繼續(xù)發(fā)育，最終發(fā)育為功能大孢子(圖版Ⅱ-7)。

翌年3月下旬，功能大孢子細胞的體積逐漸膨大并液泡化(圖版Ⅱ-8)，中央出現(xiàn)細胞核，此時為單核胚囊期(圖版Ⅱ-9)；單核胚囊的體積進一步增大，細胞核進行第1次有絲分裂，形成2個游離細胞核；2個細胞核分別轉(zhuǎn)移到胚囊的兩端，即進入二核胚囊期(圖版Ⅱ-10)；此后再進行1次有絲分裂，進入四核胚囊期(圖版Ⅱ-11)；接著進行第3次有絲分裂，形成8個游離細胞核，進入八核胚囊期，其中4個在合點端，4個在珠孔端。此后胚囊體積顯著變大，隨之兩端各有1個細胞核移向胚囊的中間，形成極核；而合點端的3個細胞形成反足細胞，珠孔端形成1個卵細胞和2個助細胞(圖版Ⅱ-12)。

翌年4月上旬(即花后約30 d)，胚囊發(fā)育完全，形成典型的單孢發(fā)生的蓼型胚囊。成熟胚囊中卵細胞多數(shù)敗育，大孢子液泡化后，多數(shù)胚囊停留在單核或雙核時期，核質(zhì)濃縮，胚囊后期一般不再繼續(xù)發(fā)育(圖版Ⅱ-13～16)。在觀察的200個胚珠中，僅觀察到41個完整的7胞8核胚囊，多數(shù)助細胞消失，僅留下發(fā)育不完全的卵細胞，成熟胚囊的卵細胞敗育率高達79.5%。

3 討論和結(jié)論

寶華玉蘭小孢子母細胞的分裂過程表現(xiàn)出比較原始的特征。與木蘭科其他種類[16]類似，寶華玉蘭有雄蕊64～72個，離生，從下至上螺旋狀排列，其雄蕊具有4個花粉囊，在經(jīng)歷了“孢原細胞分化期、小孢子母細胞形成期、單核絨氈層形成期、雙核絨氈層形成期、小孢子發(fā)育期、二分體期、四分體期、單核居中期、單核靠邊期、單核花粉期、雙核花粉期”等過程后形成成熟花藥，其成熟花粉粒為二細胞型，花藥壁由1層表皮、1層藥室內(nèi)壁、2或3層中層以及1或2層腺質(zhì)絨氈層組成。同一個花藥中花粉囊發(fā)育不同步且小孢子四分體的排列方式不同，可分為四面體型、左右對稱型和“T”型3類。寶華玉蘭的雌蕊由146～150個淺紫色離生心皮組成，由下至上螺旋狀排列，每個心皮的腹面壁上著生2枚胚珠，倒生、雙珠被、厚珠心、邊緣胎座。從胚珠原基開始，在經(jīng)歷了“胚珠發(fā)育初期、孢原細胞形成期、大孢子母細胞形成期、功能大孢子形成期、單核胚囊期、二核胚囊期、四核胚囊期、八核胚囊期”等過程后形成成熟胚囊，其大孢子為單孢子發(fā)生型，四分體直線型排列，合點端為功能大孢子，成熟胚囊為7胞8核蓼型胚囊。這些特征均與木蘭科多數(shù)植物的雌蕊特征一致，表現(xiàn)出原始性。

植物的結(jié)實率與花粉和胚囊發(fā)育異常密切相關(guān)。在木蘭科的許多種類中均存在花粉和胚囊發(fā)育異常的現(xiàn)象，例如，紅花木蓮和香木蓮的四分體小孢子階段和小孢子剛形成時均出現(xiàn)細胞變形的現(xiàn)象[24-25]；在北美鵝掌楸(LiriodendrontulipiferaLinn.)小孢子發(fā)育過程中均能觀察到小孢子收縮變形的現(xiàn)象[26]。而寶華玉蘭的小孢子釋放期、單核靠邊期、二細胞花粉期也存在異常發(fā)育的現(xiàn)象，較為嚴重的是四分體小孢子釋放期，該時期部分小孢子收縮過度并停止發(fā)育，直接導(dǎo)致花粉數(shù)量減少，最終花粉的敗育率達61.3%。但寶華玉蘭花粉數(shù)量的減少是否能直接導(dǎo)致其結(jié)實率降低，尚有待其花粉活力和花粉萌發(fā)率等方面研究結(jié)果的佐證。

寶華玉蘭的大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育過程中也存在異?，F(xiàn)象，其成熟胚囊中卵細胞多數(shù)敗育，大孢子細胞液泡化后，多數(shù)胚囊停留在單核或雙核時期，核質(zhì)濃縮，胚囊后期一般不再繼續(xù)發(fā)育，僅有少數(shù)完整的7胞8核胚囊，多數(shù)助細胞消失，僅留下發(fā)育不完全的卵細胞，最終卵細胞的敗育率達79.5%。在木蘭科種類香木蓮和落葉木蓮(ManglietiadeciduaQ. Y. Zheng)的大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育過程中也存在此現(xiàn)象[27-28]。

寶華玉蘭大小孢子發(fā)生和雌雄配子體發(fā)育中出現(xiàn)的異?，F(xiàn)象，導(dǎo)致花粉和卵細胞數(shù)量有限，進而可能影響其授粉受精，并降低結(jié)實率。而寶華玉蘭雌雄配子體發(fā)育表現(xiàn)出嚴重的不同步現(xiàn)象，也是導(dǎo)致其授粉受精失敗的一個重要原因，在木蘭科種類煥鏞木[14]和深山含笑[15]中也有該現(xiàn)象。雌雄配子體發(fā)育的不同步現(xiàn)象，雖有利于異交結(jié)實，但在種群規(guī)模較小的情況下，可能會導(dǎo)致結(jié)實率降低。

木蘭科植物有性生殖過程中出現(xiàn)的異常現(xiàn)象雖然存在種類間的差異，且敗育時期也不同，但可以明確的是，這一現(xiàn)象在瀕危植物中十分普遍。木蘭科植物瀕危的原因除了來自遺傳多樣性、生殖發(fā)育過程、物種交配系統(tǒng)以及種子發(fā)育特征等內(nèi)部因子外，也與不利的氣候環(huán)境條件等外部因子息息相關(guān)[29]。溫度、水分和土壤等環(huán)境因子對植物的生長發(fā)育都會產(chǎn)生重要作用[30]，因此，關(guān)于寶華玉蘭結(jié)實率低的原因，有待結(jié)合外部環(huán)境因子的變化，從分子、生理和發(fā)育等方面進行綜合探討。