王克芬 王興吉 閆宜江 張 杰 劉勝利 劉文龍

（山東隆科特酶制劑有限公司國家企業(yè)技術中心，山東臨沂， 276400）

蛋白酶是水解蛋白質(zhì)肽鍵的一類酶的總稱。目前蛋白酶的生產(chǎn)主要依靠微生物發(fā)酵。但是受產(chǎn)物反饋抑制，微生物分泌蛋白酶并且蛋白酶達到一定含量時，蛋白酶分泌量不再增加，并且高度聚集的蛋白酶自身水解反應會導致產(chǎn)量降低[1]。蛋白酶在提取或者儲存過程中也會存在自身水解造成活力降低的問題，影響蛋白酶的穩(wěn)定性[2]。

可逆蛋白酶抑制劑是可以與蛋白酶分子活性中心的一些基團結合，使蛋白酶活力下降，甚至消失，但不使蛋白酶變性的物質(zhì)（圖1）。該結合是競爭性的，是可逆的，當在溶液中抑制劑被稀釋或者其他底物濃度提高時，蛋白酶的活性可以恢復[3]。

圖1 可逆抑制劑

在洗滌液中添加蛋白酶，能夠提高洗滌劑的去污能力。但是洗滌液中如果還添加淀粉酶、脂肪酶等其他洗滌用酶，在蛋白酶與其他酶類混合后，這些酶類部分會被蛋白酶水解失去作用。專利CN199892.2提出了一類可逆蛋白酶抑制劑作為洗衣液添加劑，甲基酮與2～5個氨基酸的聚合物，該抑制劑能夠競爭性地抑制蛋白酶活性，提高了蛋白酶和其他酶類在洗滌劑中的穩(wěn)定性，提升了洗滌劑組合物的作用[4]。使用時，將洗衣液溶解于水中，擴大其體積，蛋白酶與可逆抑制劑解離恢復蛋白酶活性。

在發(fā)酵過程中添加可逆蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶的活性，使得活性蛋白酶減少，反饋抑制降低，微生物會繼續(xù)分泌蛋白酶完成生長需要，間接增加了蛋白酶的分泌量。蛋白酶自身的水解反應也會減弱。蛋白酶使用時經(jīng)過溶解體積擴大，可逆蛋白酶抑制劑濃度降低，蛋白酶活性恢復。這種方法生產(chǎn)的蛋白酶尤其適合在洗滌、污水處理和皮革行業(yè)使用。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

50L發(fā)酵罐，百倫生物儀器設備公司；尤尼柯 UV-2100紫外分光光度計，上海尤尼柯公司；BMY-2/450板框過濾機，成都莘明過濾設備有限公司；小試1812超濾濃縮機，合肥易潔特膜科技有限公司；LPG噴霧干燥機，常州市優(yōu)博干燥工程有限公司。

可逆抑制劑，Z- 天冬氨酰-谷氨酰-纈氨酰-天冬氨酸-氯甲基酮，合肥國肽生物科技有限公司；實驗蛋白酶菌種，枯草芽孢桿菌（保藏號32154879）；其他試劑均為國產(chǎn)實驗室常用試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基及測定方法

發(fā)酵罐配方：玉米粉2%，豆餅粉3%，麩皮3% ，Na2HPO4·12H2O 0.4%，KH2PO40.03%，ZnCl20.21%， pH 6.0 。

補料：20% 液化淀粉。

抑制劑制備：四肽氯甲基酮抑制劑的配置濃度為10.0 g/L，采用過濾除菌的方法加入預先處理的無菌水中。

酶活測定：酶活檢測方法為常規(guī)的蛋白酶酶活檢測方法[5]。實驗組實際酶活（解除抑制后酶活）檢測采用發(fā)酵液稀釋10倍解除抑制后溶液檢測酶活。酶活抑制率=（實際酶活-抑制后酶活）/實際酶活×100%。

1.2.2 發(fā)酵罐制備

兩組平行發(fā)酵罐，A組罐添加可逆性蛋白酶抑制劑，B組罐不添加抑制劑作為對照罐，其他條件一致。發(fā)酵罐裝液量30 L，發(fā)酵罐中移入1.5 L種子液，發(fā)酵培養(yǎng)10 h后開始檢測酶活，每8 h取樣測酶活。

1.2.3 無抑制劑添加發(fā)酵培養(yǎng)對照

枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵方式為液體連續(xù)補料發(fā)酵，設置兩個對照組發(fā)酵罐A1和A2不添加抑制劑，正常發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵10 h開始檢測酶活，每8 h取樣檢測酶活變化，以該組發(fā)酵罐酶活力變化數(shù)據(jù)作為對照。

1.2.4 發(fā)酵過程中添加抑制劑的方式對產(chǎn)酶的影響

將配置好的抑制劑溶液（10.0 g/L），采用一次性打入、間斷流加和連續(xù)流加的方式打入發(fā)酵罐。參考對照罐發(fā)酵結果，在酶活增長最快的起點即發(fā)酵20 h后開始加入可逆抑制劑，此時蛋白酶活力達到2000 U。一次性打入：一次性將1000 mL過濾除菌的可逆抑制劑打入發(fā)酵罐；間斷流加：從20 h開始，每隔5 h加入100 mL抑制劑，直至加入1000 mL或發(fā)酵結束；連續(xù)流加：以100 mL/h的流速，連續(xù)向發(fā)酵罐內(nèi)補充抑制劑，直至加入1000 mL或發(fā)酵結束。發(fā)酵過程中，從10 h開始每8 h取樣一次檢測酶活變化。

1.2.5 發(fā)酵過程中添加抑制劑的方式對產(chǎn)酶的影響

根據(jù)實驗結果，選擇連續(xù)流加的方式添加抑制劑，在發(fā)酵20 h后開始連續(xù)流加可逆抑制劑。7個發(fā)酵罐選擇不同的抑制劑添加量，由于發(fā)酵罐之間存在誤差，抑制劑流加量采用對蛋白酶的抑制率表示，流加量越大抑制率越高，抑制率通過酶活檢測計算獲得，所以抑制劑添加量需要時時調(diào)整，保證酶活抑制率穩(wěn)定。抑制劑不能完全抑制酶活，菌體的正常代謝需要部分蛋白酶參與，所以選擇0、10%、20%、30%、40%、50%、60%的蛋白酶酶活抑制率，通過取樣檢測酶活和實際酶活實時調(diào)整抑制劑流速，控制酶活抑制比，流加直至發(fā)酵結束，發(fā)酵結束后統(tǒng)計發(fā)酵結果。

1.2.6 抑制劑的量對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵20 h后開始連續(xù)流加可逆抑制劑。開始流加可逆蛋白酶抑制劑，7個發(fā)酵罐選擇不同的抑制劑添加量，由于發(fā)酵罐之間存在誤差，抑制劑添加量采用對蛋白酶的抑制率表示，流加蛋白酶抑制劑的量能夠抑制10%、20%、30%、40%、50%、60%的蛋白酶酶活力，通過取樣檢測酶活和實際酶活實時調(diào)整抑制劑流速，控制酶活抑制比，流加直至發(fā)酵結束。

1.2.7 蛋白酶提取對抑制劑的影響

蛋白酶生產(chǎn)過程中有兩種從發(fā)酵液中獲得粗酶的方法，即發(fā)酵液直接噴干獲得干粉粗酶和發(fā)酵液過濾后濃縮獲得液體粗酶[6]。發(fā)酵液直接噴干的方法在蛋白酶粗酶生產(chǎn)中較為常見，枯草芽孢桿菌發(fā)酵結束，發(fā)酵液加入部分調(diào)節(jié)pH鹽類或其他保護劑后，直接連通噴干設備一起噴干，在噴干過程中抑制劑和酶一起被噴干為干粉，使用時干粉用水溶解，解除抑制劑對酶的抑制效果。本文主要討論使用第二種提取方法時對抑制劑的影響，該方法需要經(jīng)過板框過濾和超濾濃縮，板框過濾過程中須添加珍珠巖和硅藻土助濾劑過濾除去菌體和其他不溶物，板框過濾后的粗酶液再經(jīng)過超濾機超濾，以達到濃縮體積并除去小分子雜質(zhì)和部分鹽的目的。

1.2.8 抑制劑對產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響

發(fā)酵液提取后的蛋白酶粗酶液在儲存過程中，由于蛋白酶自身的水解作用和穩(wěn)定性原因會不斷降低酶活，儲存時間越長蛋白酶活性越低[7]。為了在較長時間范圍內(nèi)保持較高的酶活力，需要采取措施降低蛋白酶自身的水解作用，提高蛋白酶穩(wěn)定性，有些報道中會在粗酶中加入蛋白類穩(wěn)定劑，降低蛋白酶相互水解的概率[8]。本實驗中添加的抑制劑能夠競爭性地抑制蛋白酶活性，抑制蛋白酶自身水解作用。本實驗主要研究沒有經(jīng)過超濾濃縮的液體蛋白酶成品的儲存穩(wěn)定性，在室溫條件下每天取樣檢測蛋白酶酶活變化。

2 結果與分析

2.1 無抑制劑添加發(fā)酵結果

兩個對照組發(fā)酵罐的酶活變化如圖2，10～20 h酶活增長較慢，在20～40 h增長較快，40 h后酶活增長變緩，70 h后酶活增長進一步放慢，此時發(fā)酵菌體代謝減緩，菌種自溶增多，氨氮含量上升，說明菌體衰老，發(fā)酵罐已經(jīng)沒有繼續(xù)培養(yǎng)價值，繼續(xù)培養(yǎng)至80 h后停止發(fā)酵。培養(yǎng)過程操作保持一致，兩個對照發(fā)酵罐發(fā)酵結果基本平行。

圖2 正常發(fā)酵培養(yǎng)酶活變化

2.2 抑制劑添加方式對發(fā)酵的影響

抑制劑添加方式的流加結果如圖3，B1發(fā)酵罐可逆抑制劑一次性加入酶活較低，發(fā)酵不能正常進行，原因可能是可逆抑制劑濃度累積過高，影響菌種的其他代謝。B2發(fā)酵罐連續(xù)流加可逆抑制劑，停罐后檢測實際酶活相比對照發(fā)酵罐提高41.1%。B3發(fā)酵罐間斷流加可逆抑制劑，酶活提高36.8%，但是酶活增長不穩(wěn)定，在發(fā)酵過程中也出現(xiàn)補料波動起伏較大，不易控制的問題?？赡嬉种苿┻B續(xù)流加更適合發(fā)酵控制，也能更有效地促進發(fā)酵產(chǎn)酶。

圖3 發(fā)酵罐實際酶活變化

2.3 抑制劑流加量對產(chǎn)酶的影響

對照發(fā)酵罐與六組實驗發(fā)酵罐發(fā)酵結束后對發(fā)酵結果統(tǒng)計見表1。抑制劑的添加量逐漸增加，停罐后實際酶活力也不斷提升， 40%抑制率的添加量能夠提高酶活力49.1%，抑制劑繼續(xù)增加對酶活促進能力反而減弱甚至出現(xiàn)反作用，可能是過高的抑制劑影響了菌體的正常代謝。發(fā)酵過程中流加抑制劑控制40%的抑制率，添加的抑制劑總量約為600 mL，考慮到發(fā)酵過程中補料與放料對抑制劑含量的影響，發(fā)酵液中的抑制劑含量約在0.1 g/L。

表1 抑制劑流加量對產(chǎn)酶的影響

2.4 發(fā)酵液提取蛋白酶對抑制劑的影響

對實驗發(fā)酵液經(jīng)過板框過濾和超濾濃縮后檢測酶活結果如表2，板框過濾的方法，只能除去發(fā)酵液中的不溶雜質(zhì)，包括菌體、部分培養(yǎng)基質(zhì)，對可溶性成分幾乎不起作用，可逆抑制劑能夠通過板框過濾，所以板框過濾對蛋白酶抑制效果沒有影響。超濾濃縮過程能夠截留大分子量的蛋白質(zhì)，分子量較小的抑制劑分子可以通過超濾膜，隨著超濾時間的延長，粗酶液體積不斷變小，抑制劑對蛋白酶的抑制效果也不斷降低，說明超濾過程能夠除去可逆蛋白酶抑制劑，降低或解除抑制效果。液體蛋白酶若需要在儲存過程中抑制蛋白酶活性，保持其穩(wěn)定性，可以不經(jīng)過超濾濃縮或在超濾后適量補充可逆蛋白酶抑制劑。

表2 抑制劑對發(fā)酵液提取蛋白酶的影響

2.5 蛋白酶成品穩(wěn)定性

經(jīng)過發(fā)酵液直接噴干獲得的固體蛋白酶成品穩(wěn)定性較高，我們主要研究了沒有經(jīng)過超濾濃縮的液體蛋白酶成品的儲存穩(wěn)定性，在室溫條件下每天取樣檢測蛋白酶酶活，酶活變化如圖4，以初始蛋白酶活力100%作為參照，相同蛋白含量和酶活的兩個樣品，沒有抑制劑成分的蛋白酶成品在儲存30 d后酶活降低至90%，90 d降低至70%以下。抑制后的蛋白酶成品在儲存90 d后酶活仍然100%以上，儲存過程中酶活略有升高的原因是在高濃度的酶溶液中部分被競爭抑制的酶活在長時間儲存后釋放。

圖4 抑制劑對蛋白酶儲存的影響

3 結論

可逆蛋白酶抑制劑能夠可逆地抑制蛋白酶活性，降低發(fā)酵產(chǎn)酶過程中的反饋抑制，增加蛋白酶產(chǎn)量。蛋白酶產(chǎn)品中的可逆抑制劑可以通過超濾去除，也可以保留，含有可逆抑制劑能夠增加蛋白酶產(chǎn)品的穩(wěn)定性，并且在稀釋后可恢復蛋白酶活性對蛋白酶的使用影響較小。