劉建寧, 孫 立, 牛志云, 溫樹鵬, 王 穎, 張學軍, 王福旭

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院血液科；河北省血液病重點實驗室, 河北 石家莊 050000)

異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)通過移植物抗白血病效應(graft-versus-leukemia, GVL)實現(xiàn)了對血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治愈效果，執(zhí)行GVL的供者T淋巴細胞經(jīng)歷活化擴增及效應的過程后清除白血病細胞，成為中高危急性白血病(acute leukemia，AL)有效的治療手段。而移植后復發(fā)是allo-HSCT后最常見的死亡原因。一旦復發(fā)，預后很差，總體5年生存率僅為5%[1-2]。目前針對復發(fā)的治療手段有：調(diào)整免疫抑制劑、補救性放療化療、去甲基化藥物治療、細胞治療、靶向治療等[3]。這些方案能起到一定程度上的改善效果，但結(jié)果仍不理想。白血病復發(fā)的可能原因包括白血病細胞的耐藥機制，其生物學特性出現(xiàn)改變，對GVL效應不敏感從而實現(xiàn)免疫逃逸；也有研究表明白血病細胞丟失了不相合的HLA單倍體表型，導致主要或次要組織相容性復合體表達降低，不被免疫細胞識別從而復發(fā)；而腫瘤通過激活以程序性死亡蛋白1(PD-1)為代表的免疫檢查點轉(zhuǎn)導的負調(diào)控通路來抑制免疫反應逃避免疫的機制愈受重視。PD-1是表達于T淋巴細胞的免疫抑制性受體，腫瘤細胞浸潤的T淋巴細胞PD-1的表達突出明顯，活化的T淋巴細胞經(jīng)抗原識別后表達PD-1，并分泌干擾素，誘導組織中其配體(programmed death ligand-1，PD-L1)的表達，腫瘤細胞表達PD-L1與PD-1結(jié)合，抑制T淋巴細胞功能。本研究收集2019年3月至2020年2月于河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院行allo-HSCT患者40例的臨床資料，同期健康者23例，動態(tài)比較兩組T淋巴細胞PD-1的表達水平，重點分析移植后患者T淋巴細胞表面PD-1表達水平變化及臨床意義，以便為后期治療提供參考，報道如下。

1 資料與方法

1.1研究對象 本研究所觀察患者組病例均來自2019年3月至 2020年2月于河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院行allo-HSCT患者40例，男21例，女19例，平均年齡(33.30±10.67)歲；急性髓細胞白血病(AML)21例，急性淋巴性細胞白血病(ALL)16例，慢性粒細胞白血病(CML)加速期 1例，急性混合細胞白血病(MPAL)2例。同期健康志愿者23例，設為健康對照組，其中男性15例，女性8例，平均年齡(45.65±10.40)歲。所有患者均通過細胞形態(tài)學、免疫學、分子生物學及細胞遺傳學等檢查確診，符合惡性血液病診斷標準[4]。研究均獲得患者的知情同意并簽署知情同意書，符合2013年修訂的《赫爾辛基宣言》的要求。

1.2移植情況 移植患者移植前原發(fā)病危險分層：高危17例，中危16例，低危7例[5-6]。移植均為親緣供者，其中人類白細胞抗原(HLA)全相合12例，單倍型相合28例。干細胞來源:外周血干細胞(PBSC)10例，因國內(nèi)外研究表明采用臍帶血等第三方細胞輔助allo-HSCT等促進供者造血干細胞植入，降低GVHD發(fā)生率，減少復發(fā)死亡率，改善allo-HSCT預后[7-9]，故研究對象中有30例患者干細胞源于PBSC+臍帶血(CB)。血型相合20例，血型不合20例，供受者性別相同22例，不同18例。

1.3預處理方案 均采用清髓預處理方案，劑量均遵從中國allo-HSCT治療血液系統(tǒng)疾病專家共識(I)[10]。見表1。

表1 移植患者組清髓預處理方案

1.4干細胞動員、采集及回輸 動員應用重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)皮下注射，rhG-CSF(5-10 μg/kg·d)，4～7天。第4～7天采集外周血干細胞，采集目標為MNC≥5×108/kg受者體重，CD34+細胞≥2×106/kg受者體重。本研究患者回輸細胞情況為MNC中位數(shù)9.883(7.199, 13.261)×108/kg受者體重，CD34+細胞中位數(shù)4.434(3.621, 5.795)×106/kg受者體重。

1.5植入情況 移植效果以造血干細胞回輸后連續(xù)3天中性粒細胞計數(shù)>0.5×109/L的第1天為粒細胞植入；不依賴血小板連續(xù)輸注7天血小板計數(shù)>20×109/L的第1天為血小板植入。

1.6移植物抗宿主病(GVHD)的診斷與治療 移植后急性、慢性移植物抗宿主病參照NIH 2005[11]、NCI 2011[12]標準進行診斷和評估。GVHD的常規(guī)預防采用環(huán)孢素A(CsA)+嗎替麥考酚酯(MMF)+短療程甲氨蝶呤(MTX)+蘆可替尼，CsA起始劑量1.5 mg/kg每12小時1次，靜脈輸注，-1天開始，消化道癥狀消失后改為口服，一般移植后3個月逐漸減量，6個月停用，根據(jù)復發(fā)風險和GVHD情況酌情縮短或延長其應用時間，MTX于+1、+3、+6天給藥，并于用藥24小時后給予甲酰四氫葉酸鈣解救，個別患者給予預防性供者淋巴細胞輸注(DLI)。GVHD的治療首先根據(jù)環(huán)孢素濃度適當調(diào)整CsA用量，同時給予甲潑尼龍1～2 mg/kg，若病情3天后進展或5～7天后未緩解，考慮給予MTX、注射用重組人II型腫瘤壞死因子受體抗體融合蛋白、抗CD25單克隆抗體等二線藥物治療[13]。

1.7病情監(jiān)測 分別于移植后1、2、3、4.5、6個月留取患者外周血、骨髓，進行血常規(guī)、骨髓細胞形態(tài)學、微小殘留檢測、融合基因、細胞遺傳學、分子生物學等檢測，骨髓、外周血供受者DNA嵌合、性染色體錯配的監(jiān)測，以評估患者疾病狀態(tài)。微小殘留檢測采用熒光素標記的單克隆抗體及流式細胞儀檢測細胞抗原的表達及表達量，本研究MRD陽性復發(fā)的患者6例，其中，AML 3例、B-ALL 1例、T-ALL 1例、MPAL 1例，分別于移植后0.5、1.5、9、17、2、3個月復發(fā)，同時留取外周血標本監(jiān)測PD-1的表達水平。

1.8PD-1檢測 實驗所需試劑均購于Biolegend公司，應用流式細胞儀(品牌：美天旎，型號：MACSQuant 10)檢測外周血標本PD-1在CD3+CD4+, CD3+CD8+T淋巴細胞的表達水平。各取100 ul抗凝處理后全血加入到2個EP管中，向管1中加入2 ul CD8 Pacific Blue(貨號301033)、PD1-FITC(貨號329904)、CD4-PE/CY7(貨號300512)、CD3-APC/CY7(貨號300426)、7AAD(貨號420404)，管2中加入同型對照CD8 Pacific Blue、IgG1-FITC(貨號78080)、CD4-PE/CY7、CD3-APC/CY7、7AAD混勻，于4℃環(huán)境下避光孵育10 min；離心后棄上清液，并加入裂解液混勻，室溫避光10-15 min以裂解紅細胞。裂解后離心棄上清，加入FBS，重懸細胞，上機檢測。應用Flowjo軟件分析：圈定細胞門P1門后，在P1門內(nèi)設置CD3/SSC顯示CD3占所有有核細胞的比例；在CD3門內(nèi)，以“十字門”的方式畫出CD4+PD1+/CD4-PD1+細胞；另外再在CD4門和CD8門內(nèi)以畫出PD-1+細胞的比例。

2 結(jié) 果

2.1移植后PD-1在CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞的表達水平變化 移植后1～6個月PD-1在CD3+CD4+、CD3+CD8+T細胞的表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P=0.002)，且表達水平呈現(xiàn)逐漸下降的變化。見表2、圖1。

表2 PD-1在T淋巴細胞的表達水平

圖1 移植組PD-1表達水平隨移植后時間的變化

2.2移植組1～6個月與對照組PD-1的表達水平比較 結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植后1～6個月PD-1在CD3+CD4+T細胞的表達水平逐漸下降，但均高于對照組，移植后表達水平最低的第6個月和對照組PD-1的表達水平差異有統(tǒng)計學意義(U=54.000，P=0.003)；移植組PD-1在CD3+CD8+T細胞的表達水平在移植后1、2個月高于對照組(U=44.000，P<0.01)，移植后3、4.5、6個月CD3+CD8+T細胞和對照組PD-1的表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(U=115.000，125.000，110.000，P=0.267，0.434，0.202)。

2.3PD-1表達水平對MRD陽性復發(fā)的提示意義 根據(jù)34例MRD陰性組患者T淋巴細胞PD-1的表達數(shù)據(jù)，分別統(tǒng)計移植后1、2、3、4.5及6個月不同時間點表達水平的均值范圍。本研究中MRD陽性復發(fā)患者6例，其中4例未于MRD陽性復發(fā)前采樣檢測均不納入統(tǒng)計，1例復發(fā)患者在MRD復發(fā)前曾行DLI治療，PD-1表達水平低于未DLI組，故未納入MRD陽性組分析，剩余1例患者復發(fā)前3個月(移植后6個月)PD-1在CD3+CD4+、CD3+CD8+T細胞的表達水平54.20%；37.30%，高于總體均值范圍(29.27±15.08)%；(17.18±17.50)%。

3 討 論

allo-HSCT作為治愈AL的主要治療方案，移植物存在抗白血病效應(GVL)是造血干細胞移植能夠治愈AL的主要機制。而移植后復發(fā)，嚴重影響著移植后患者的長期生存時間和狀態(tài)，可能由GVL效應丟失導致。目前研究分析GVL效應丟失的原因：①白血病細胞HLA Ⅱ類分子丟失；②白血病細胞獲得新的基因突變；③T淋巴細胞PD-1表達上調(diào)；④白血病細胞PD-L1表達升高。

PD-1作為CD28家族的成員之一，表達于T淋巴細胞、單核細胞、樹突狀細胞等多種免疫細胞，通過與其配體PD-L1相互作用引起T細胞衰竭而發(fā)揮負性免疫調(diào)控效應[14]。其轉(zhuǎn)導的信號通路干擾T細胞的活化和增殖，使T細胞處于衰竭狀態(tài)，免疫細胞功能差，抑制性受體持續(xù)表達，妨礙免疫系統(tǒng)對感染和腫瘤細胞的最佳控制[15]。Simonetta等[16]分析了105例allo-HSCT受者分離的T細胞亞群上PD-1的表達，結(jié)果顯示allo-HSCT后表達PD-1的CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞的比例在移植后早期明顯增加，且PD-1在CD3+CD8+T細胞表面的表達只呈現(xiàn)了一過性增加，隨時間推移逐漸趨于正?；?，而在CD3+CD4+T細胞表面的表達呈現(xiàn)早期和長期的增加，雖有下降趨勢，但在研究的所有時間點中(包括allo-HSCT后5年以上的患者)，其表達比例仍明顯高于健康對照水平。本研究顯示，allo-HSCT后1個月到6個月PD-1在CD3+CD4+T細胞的表達一直處在高于健康者的水平，但有明顯的下降趨勢；而在CD3+CD8+T細胞的表達雖然也呈下降趨勢，但在3個月開始，與健康者水平差異無明顯統(tǒng)計學意義，與之前報道吻合。表明allo-HSCT后PD-1在CD3+CD4+和CD3+CD8+T細胞表面的表達變化過程不同，CD3+CD4+T細胞表面PD-1表達上調(diào)持續(xù)時間相對長，不除外持續(xù)性升高，需延長研究時間證實；而CD3+CD8+T細胞表面PD-1則呈現(xiàn)瞬時過表達的特點。

同時Kong等[17]研究了allo-HSCT的AML患者11例外周血樣本并進行流式細胞術(shù)檢測，其中5例在移植后2～6個月出現(xiàn)白血病復發(fā)，余6例在采血點(移植后3～6個月)一直處于緩解狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在復發(fā)患者中始終檢測到高表達PD-1的細胞比例增加，提示PD-1在allo-HSCT后白血病復發(fā)中有著預測價值。Noviello等[18]研究了PD-1等抑制性受體在32例AML患者的骨髓浸潤T細胞的表達在allo-HSCT后復發(fā)或完全緩解后的差異，發(fā)現(xiàn)移植后復發(fā)的患者PD-1在CD3+CD8+T細胞表達的比例均高于緩解的患者。本研究中分析復發(fā)患者復發(fā)前PD-1表達水平與對應移植后時間點未復發(fā)患者組表達水平的總體均值，發(fā)現(xiàn)了復發(fā)前PD-1在CD3+CD4+、CD3+CD8+T細胞的表達水平高于未復發(fā)總體的現(xiàn)象。如報道所言，PD-1表達上調(diào)，其介導的信號通路抑制T淋巴細胞的功能活化，減少T淋巴細胞的增殖，增加T細胞功能缺陷。以此可推測，當移植后患者PD-1檢測表達升高時，衰竭T細胞增加，機體免疫下降，從而促進腫瘤細胞逃脫免疫監(jiān)視，導致疾病復發(fā)。

基于以上研究，目前PD-1抑制劑在allo-HSCT后患者的治療中應用逐漸增多。Berger等[19]在pidilizumab的I期臨床試驗中，應用于8例AML晚期患者，其中4例曾行allo-HSCT，1例于口服pidilizumab第21天外周幼稚細胞從50%降至5%，提示PD-1抑制劑的抗腫瘤效果。Ravandi等[20]曾在對AML患者的治療中應用nivolumab，44例患者中有42例AML患者，2例MDS高?；颊撸o予患者誘導化療的同時，在第1～3天使用nivolumab，3 mg/kg，應答者接受最多5個鞏固周期或行allo-HSCT，結(jié)果顯示44例患者中34例(78%)患者達到完全緩解(CR)或部分緩解(CRi)，其中在應答時有微小殘留病的16例患者中9例(56%)給予了nivolumab維持治療并在1～3個月后微小殘留病轉(zhuǎn)為陰性。然而，PD-1抑制劑應用有效的同時，GVHD似乎也有所增加或加重的可能。Ravandi等[20]研究的44例患者中18例行allo-HSCT，其中13例(Ⅰ～Ⅱ級8例，Ⅲ～Ⅳ級5例)發(fā)生aGVHD。Haverkos等[21]對接受PD-1抑制劑治療的31例allo-HSCT后復發(fā)的淋巴瘤患者進行了多中心回顧性分析，病例中8例(26%)死亡患者與抗PD-1治療后新發(fā)GVHD有關(guān)，17例(55%)在開始使用抗PD-1后出現(xiàn)治療應急型GVHD(6例急性，4例重疊，7例慢性)，9例為Ⅲ～Ⅳ級的急性或重度慢性GVHD，表明PD-1抑制劑治療可能并發(fā)嚴重和難治的GVHD。雖然也有惡性腫瘤移植后復發(fā)的早期臨床試驗中，未發(fā)現(xiàn)ipilimumab治療會誘發(fā)或加劇GVHD[22]；Simonetta等[16]在分析T細胞表面PD-1的表達與移植后并發(fā)癥的關(guān)系時，也未檢測到aGVHD患者CD4+、CD8+T細胞上PD-1的表達有顯著差異，表明GVHD對allo-HSCT后T細胞上PD-1表達的影響很小。但PD-1抑制劑的臨床應用在令研究者懷有希望的同時因是否直接影響GVHD的發(fā)生而受阻，如何分離GVL效應和GVHD，在加強GVL效應的同時最大程度的減少或減輕GVHD還需進一步研究，如聯(lián)合其他免疫檢查點抑制劑、減少應用劑量等。

綜合文獻及研究結(jié)果，急性白血病患者移植后早期PD-1在CD3+CD4+T淋巴細胞的表達較正常水平升高且隨移植時間呈現(xiàn)下降趨勢；在CD3+CD8+T淋巴細胞的表達于移植后早期呈現(xiàn)一過性升高。早期應用免疫抑制劑可能會減少復發(fā)，但對GVHD的相關(guān)性及預防需進一步研究。