葉 丹，章佳波，姚玲莉，郭 宇

(1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.寧波市第一醫(yī)院，甲狀腺乳腺外科、整復(fù)美容中心，浙江 寧波 315010)

甲狀腺癌是人體最常見的頭頸部及內(nèi)分泌系統(tǒng)的惡性腫瘤，是近些年來發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一[1]。其最常見的類型為甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer，PTC)，而根據(jù)相關(guān)報(bào)道，甲狀腺微小乳頭狀癌(papillary thyroid microcarcinoma, PTMC)占新檢出的PTC近一半[2]。目前對于PTMC的治療主要以手術(shù)為主，但對于臨床淋巴結(jié)陰性的患者是否行中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃存在較大的爭議。有相關(guān)研究表明cyclinD1、p27表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性[3]。本研究采用免疫組織化學(xué)方法對60例PTMC甲狀腺腫瘤組織的cyclinD1、p27表達(dá)進(jìn)行檢測，并分析cyclinD1、p27表達(dá)與超聲顯像特征、PTMC中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，以期為PTMC的評估、診治提供指導(dǎo)作用。

1 資料與方法

1.1病例選擇 收集2019年3-8月在我院行中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃的PTMC患者的腫瘤組織60例，男15例，女45例，平均年齡(46.4±12.81)歲，結(jié)節(jié)邊界不清患者48例(80.0%)，形態(tài)不規(guī)則患者14例(23.3%)，結(jié)節(jié)內(nèi)存在微小鈣化或粗大鈣化患者37例(61.7%)，結(jié)節(jié)內(nèi)部或周邊有血流患者44例(73.3%)，縱橫比≥1患者35例(58.3%)，多灶14例(23.3%)。術(shù)前超聲檢查未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，術(shù)后常規(guī)病理均證實(shí)為PTMC，入組的病灶腫瘤最大徑控制在5～10 mm。根據(jù)術(shù)后中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)病理檢查結(jié)果，選擇中央淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，其中男9例，女21例，平均年齡(42.37±12.03)歲；選擇未轉(zhuǎn)移患者30例作為對照，其中男6例、女24例，平均年齡(50.43±12.48)歲。

1.2方法

1.2.1主要試劑 CyclinD1抗體試劑及p27抗體試劑均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。DAB顯色試劑盒、EnVision檢測試劑盒均購自丹麥丹科私人有限公司。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色 所有手術(shù)切除標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)3 μm厚度切片。采用免疫組織化學(xué)EnVision兩步法，檢測組織中CyclinD1、p27的表達(dá)情況，主要步驟如下：石蠟切片脫蠟至水，組織抗原修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，正常羊血清封閉，滴加一抗，PBS洗后滴加二抗，DAB染色及蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。用已知陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.3超聲特征 由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的超聲科醫(yī)生分別判讀超聲圖像并記錄以下6個(gè)超聲顯像特征：①甲狀腺結(jié)節(jié)邊界；②結(jié)節(jié)形態(tài)；③結(jié)節(jié)鈣化；④結(jié)節(jié)血流；⑤結(jié)節(jié)縱橫比；⑥病灶數(shù)。

1.3結(jié)果判定 cyclinD1、p27主要表達(dá)于細(xì)胞核，部分胞漿著色。由病理專家評片，根據(jù)高倍鏡下細(xì)胞核著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率進(jìn)行評分(Thomas綜合計(jì)分法)綜合判斷細(xì)胞核著色強(qiáng)度評分：無著色0分；淡黃色1分；棕黃色2分；棕褐色3分。計(jì)數(shù)400個(gè)細(xì)胞，按陽性細(xì)胞所占比例評分，<5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；> 75%為4分。2項(xiàng)評分相加：<2分為陰性(-)；2～3分為弱陽性(+)；4～5分為中度陽性(++)；6～7 分為強(qiáng)陽性(+++)。本研究中陰性(-)、弱陽性(+)為低表達(dá)；中度陽性(++)、強(qiáng)陽性(+++)為高表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組超聲特征分析 兩組性別、結(jié)節(jié)形態(tài)、結(jié)節(jié)有無血流方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。而在結(jié)節(jié)邊界、鈣化、縱橫比及原發(fā)病灶數(shù)方面比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)移組結(jié)節(jié)邊界不清、結(jié)節(jié)存在鈣化發(fā)生率、縱橫比≥1及原發(fā)病灶數(shù)為多灶發(fā)生率更高(P<0.05)。見表1。

表1 兩組超聲特征分析[例(%)]

2.2兩組cyclinD1、p27表達(dá)情況分析 轉(zhuǎn)移組cyclinD1陽性表達(dá)27例(90%)，高表達(dá)23例(76.7%)；未轉(zhuǎn)移組cyclinD1陽性表達(dá)有24例(80%)，高表達(dá)18例(60%)；與未轉(zhuǎn)移組相比，轉(zhuǎn)移組高表達(dá)病例數(shù)占比相對較多。p27在轉(zhuǎn)移組中，陽性表達(dá)有22例(73.3%)，多數(shù)為弱陽性(16例)，低表達(dá)共有24例(80%)；在未轉(zhuǎn)移組中，陽性表達(dá)有28例(93.3%)，多數(shù)為弱陽性(15例)，低表達(dá)共有17例(56.7%)；轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組相比，低表達(dá)病例數(shù)占比相對較多。其中，轉(zhuǎn)移組中CyclinD1高表達(dá)聯(lián)合p27低表達(dá)病例數(shù)有18例，未轉(zhuǎn)移組中CyclinD1高表達(dá)聯(lián)合p27低表達(dá)10例；兩組對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.286，P=0.038)。

2.3cyclinD1、p27表達(dá)與超聲特征的關(guān)系 cyclinD1表達(dá)與性別、年齡、結(jié)節(jié)形態(tài)、結(jié)節(jié)血流及原發(fā)病灶數(shù)方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；cyclinD1表達(dá)與結(jié)節(jié)邊界、存在鈣化及縱橫比方面差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；cyclinD1高表達(dá)的結(jié)節(jié)邊界不清、存在鈣化或縱橫比≥1發(fā)生率更高。見表2。

表2 cyclinD1表達(dá)與超聲特征分析[例(%)]

2.4p27表達(dá)與超聲特征的關(guān)系 p27表達(dá)與性別、年齡、結(jié)節(jié)邊界、形態(tài)、鈣化及血流方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；p27表達(dá)與結(jié)節(jié)縱橫比存在關(guān)系(P<0.05)，p27低表達(dá)的縱橫比≥1發(fā)生率更高。見表3。

表3 p27表達(dá)與超聲特征分析[例(%)]

3 討 論

近些年來，隨著高分辨率超聲的普及及甲狀腺細(xì)針穿刺技術(shù)的提高，甲狀腺癌的檢出率呈逐年上升趨勢，其中最為常見的為PTMC[4]。雖然PTMC大多數(shù)表現(xiàn)為良好的生物學(xué)行為，病程進(jìn)展緩慢，預(yù)后較好，但有研究顯示PTMC的中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率可達(dá)24%～64%[5]。而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響PTMC患者局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)期生存的重要影響因素。因此探討預(yù)測PTMC中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的超聲顯像特征及有效指標(biāo)具有重要意義。

Liu等[6]進(jìn)行了一項(xiàng)包含4 573例PTMC患者的研究分析，其結(jié)果顯示性別、多灶性是PTMC中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。孫彤等[7]研究發(fā)現(xiàn)PTMC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在性別、結(jié)節(jié)縱橫比、血流方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而結(jié)節(jié)的邊緣不規(guī)整、形態(tài)不規(guī)則、存在鈣化以及多灶是PTMC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。王猛等[8]研究認(rèn)為結(jié)節(jié)縱橫比≥1與PTMC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，這與本研究結(jié)果相符合。本研究顯示結(jié)節(jié)邊界不清、結(jié)節(jié)內(nèi)存在微小鈣化或粗大鈣化、縱橫比≥1以及原發(fā)病灶為多灶的與中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。而性別、結(jié)節(jié)形態(tài)以及結(jié)節(jié)血流并不是PTMC中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。

CyclinD是細(xì)胞周期素家族中最重要的成員，其編碼的蛋白對調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中G1期向S期的進(jìn)展有非常重要的促進(jìn)作用，它可以與周期素依賴性蛋白激酶(cdk)4/6結(jié)合形成復(fù)合物，使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(pRb)磷酸化并失活。pRb的失活促使細(xì)胞周期從G1期進(jìn)展到S期。當(dāng)cyclinD1過表達(dá)時(shí)，可造成細(xì)胞增殖過度[9]。cyclinD1在多種惡性腫瘤中均表現(xiàn)出過表達(dá)狀態(tài)[10-11]。cyclinD1的異常高表達(dá)與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性[12]。研究發(fā)現(xiàn)cyclinD1在甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中表達(dá)明顯增高[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，CyclinD1在PTMC中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中陽性表達(dá)比例明顯高于未轉(zhuǎn)移組，說明CyclinD1與PTMC中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)系。

p27是一種位于染色體上的抑癌基因，其對細(xì)胞周期的抑制作用是通過CDKs抑制介導(dǎo)的。它可以編碼CDK抑制的核蛋白，并在細(xì)胞周期的G0和G1期早期抑制CyclinD1/cdk復(fù)合物的形成，從而抑制pRb的失活，阻止細(xì)胞周期由G1到S期的進(jìn)程[15]。甲狀腺癌p27的表達(dá)低于正常甲狀腺組織，轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌中p27的表達(dá)明顯低于未轉(zhuǎn)移的[16]。我們的研究顯示，中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTMC中p27的表達(dá)明顯低于中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的PTMC，說明p27在判斷PTMC中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)有一定的作用，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CyclinD1呈過表達(dá)和p27呈低表達(dá)在多種惡性腫瘤中有該現(xiàn)象，其與腫瘤侵襲性增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率及預(yù)后不良有關(guān)[17]。本研究證實(shí)cyclinD1過表達(dá)和p27低表達(dá)是鑒別PTMC中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有效指標(biāo)。有助于更容易識(shí)別中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高的PTMC患者，并采取相應(yīng)的手術(shù)方式予以治療。

就目前情況來看，超聲對PTMC中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷精確度還不夠，但毫無疑問超聲仍然是術(shù)前評估甲狀腺原發(fā)病灶和中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)的重要檢查手段。本研究分析了免疫組織化學(xué)檢測cyclinD1、p27的表達(dá)情況與中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移超聲顯像特征的關(guān)系，認(rèn)為當(dāng)超聲顯像顯示結(jié)節(jié)邊界不清、結(jié)節(jié)內(nèi)存在微小鈣化或粗大鈣化同時(shí)伴有cyclinD1高表達(dá)時(shí)，中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能性較大，需行預(yù)防性中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃。當(dāng)結(jié)節(jié)縱橫比≥1伴cyclinD1高表達(dá)或p27低表達(dá)時(shí)，中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能也較大，需行預(yù)防性清掃。當(dāng)結(jié)節(jié)多灶性同時(shí)伴p27低表達(dá)時(shí)，根據(jù)本研究結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但P值接近0.05，其結(jié)果還需要更大樣本量的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。