吳孔陽，原瑞材，楊同香, 郝道寬, 王 震，李闖鵬，郭肖華

(1. 洛陽師范學院 生命科學學院，河南 洛陽 471934； 2. 河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；3. 黃淮學院 生物與食品工程學院，河南 駐馬店 463000)

羊肚菌(Morchella)隸屬于子囊菌亞門(Ascomycotina)、盤菌綱(Discornycetes)、盤菌目(Pezizales)、羊肚菌科 (Morchellaceae)、羊肚菌屬(Morchella)，是一種世界公認的珍稀食用藥用菌[1]. 由于它的菌蓋表面凹凸不平、狀如羊肚，故名羊肚菌. 研究表明，羊肚菌多糖具有多種生物活性，包括抗氧化[2-4]、抗腫瘤[5]、免疫調節(jié)[6]、降低膽固醇[7]、抗黑色素生成[8]等. 目前，羊肚菌多糖的提取純化及生物活性成為研究的熱點.

近年來，有關羊肚菌多糖的提取著重從羊肚菌菌絲體及發(fā)酵液中進行[9-11]，從子實體提取羊肚菌多糖的報道較少[12]. 多糖提取方式主要有水提醇沉法[13]、酶解提取法[14]、超聲波輔助提取法等[15]. 水提取方法因其簡單安全，在工業(yè)上被廣泛應用. 目前對子實體羊肚菌多糖水提法研究相對較少，本實驗擬開展熱水浸提法獲取羊肚菌多糖，并對其參數(shù)進行了優(yōu)化. 采用苯酚-硫酸法對羊肚菌多糖含量進行測定，考察了水料比、提取溫度、提取時間對羊肚菌多糖得率的影響，通過響應面法對提取參數(shù)進行優(yōu)化，旨在為羊肚菌子實體的開發(fā)利用提供參考.

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

材料：羊肚菌子實體由河南省南山菇業(yè)有限公司提供； 苯酚、硫酸等試劑均為分析純.

主要儀器：紫外可見分光光度計(UV-5100)，上海元析儀器有限公司； 傾斜式高速萬能粉碎機(FW-400A)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 羊肚菌多糖提取流程

將羊肚菌在40 ℃條件下烘干4 h后，粉碎機粉碎. 稱取1.000 0 g羊肚菌粉置于小燒杯中，按一定水料比加水，水浴恒溫一定時間，離心機(4 000 r/min)離心10 min，得到提取液.

1.2.2 單因素實驗

(1)提取時間對多糖提取率的影響

稱取1.000 0g干燥的羊肚菌粉，固定水料比50∶1 (mL/g)、提取溫度60 ℃，選取提取時間1 h、2 h、3 h、4 h、5h，按照1.2.1提取流程和1.3.2多糖含量的測定進行實驗.

(2)水料比對多糖提取率的影響

稱取1.000 0 g干燥的羊肚菌粉，在上述優(yōu)化條件下，選取水料比20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1(mL/g)，按照1.2.1提取流程和1.3.2多糖含量的測定進行實驗.

(3)提取溫度對多糖提取率的影響

稱取1.000 0 g干燥的羊肚菌粉，在上述優(yōu)化條件下，選取溫度25 ℃、40 ℃、55 ℃、70 ℃、85 ℃，按照1.2.1提取流程和1.3.2多糖含量的測定進行實驗.

1.2.3 響應面優(yōu)化實驗

在單因素實驗結果的基礎上，結合Box-Behnken中心組合實驗設計原理，對水料比(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)按照三因素三水平進行編碼，實驗設計中的水平及編碼見表1. 最后以多糖提取率為響應值，利用軟件Design Expert 10.0.4.0對試驗數(shù)據(jù)進行分析.

表1 因素水平編碼表

1.3 多糖測定及方法

1.3.1 葡萄糖標準曲線的繪制

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量. 精確稱量無水葡萄糖1.0000 g于100 mL容量瓶中定容. 再取出1 mL溶液于100 mL容量瓶中定容. 分別取出0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL至試管中，每組濃度做三次平行，各試管分別加入蒸餾水至2 mL，加入5%苯酚1 mL、濃硫酸5 mL，于沸水浴中加熱15 min. 取出放入冷水中降溫，用紫外-可見光分光光度計測定各試管中樣品在490 nm處的吸光值. 得到的數(shù)據(jù)經(jīng)Excel回歸分析得到線性回歸方程，以吸光度值X為橫坐標，多糖濃度Y(μg/mL)為縱坐標，繪制標準曲線.

1.3.2 羊肚菌多糖含量的測定

從提取液中取適當量的樣品至試管中，每個樣品做三組平行，加蒸餾水稀釋至2 mL，加入5%苯酚1 mL、濃硫酸5 mL，于沸水浴中加熱15 min. 取出放入冷水中降溫，用紫外-可見光分光光度計測定各試管中樣品在490 nm處的吸光值.

1.3.3 樣品多糖得率計算

根據(jù)標準曲線線性回歸方程求得多糖濃度Y； 根據(jù)式(1)，求得樣品多糖得率W.

W(%)=(C×V×N×10-6/M)×100

(1)

式(1)中，W為多糖得率(%)；C為多糖濃度(μg/mL)；V為定容體積(mL)；N為稀釋倍數(shù)；M為樣品質量(g).

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取時間對多糖得率的影響

提取時間對多糖提取有顯著的影響，提取時間對羊肚菌多糖得率的影響如圖1所示. 隨著提取時間的延長，多糖的浸出量也逐漸增多，在3 h時達到最大，然后隨著提取時間增長，羊肚菌多糖得率趨于平緩.

圖1 提取時間對羊肚菌多糖得率的影響

2.1.2 水料比對多糖得率的影響

水料比對羊肚菌多糖得率的影響如圖2所示. 當水料比在20∶1、30∶1、40∶1(mL/g)時，羊肚菌多糖得率趨于一致，而在水料比為50∶1(mL/g)時，羊肚菌多糖得率最高，之后多糖得率下降.

圖2 水料比對羊肚菌多糖得率的影響

2.1.3 提取溫度對多糖得率的影響

提取溫度對羊肚菌多糖得率的影響如圖3所示. 開始多糖含量隨溫度的升高而升高，40 ℃時達到最大，超過40 ℃時，羊肚菌多糖得率降低. 這可能是在高溫提取條件下多糖的結構不穩(wěn)定所致.

圖3 提取溫度對羊肚菌多糖得率的影響

2.2 響應面分析法對羊肚菌多糖提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 Box-Behnken實驗設計及結果

根據(jù)單因素實驗結果，在影響羊肚菌多糖得率的3個因素中分別選取三個水平進行編碼(表1)，并進行響應面優(yōu)化實驗，結果見表2.

表2 響應面實驗設計及結果

2.2.2 回歸模型的建立及方差分析

借助Design Expert 10.0.4.0對表2實驗結果進行多元回歸擬合，得二次多項式回歸模型：Y=7.02535-0.051975A+1.02305B+0.38452C+0.23469AB+0.36904AC+0.0854508BC-0.86672A2-1.39369B2-0.50324C2.

回歸模型方差分析結果見表3. 回歸模型極顯著(p=0.0042<0.01)，失擬項不顯著(p=0.336 4>0.05)； 回歸方程總決定系數(shù)R2=0.920 4，表明模型對實驗擬合度較好，可用該模型對實驗結果進行預測. 從表3中可以看出，模型中一次項B、二次項B2影響極顯著，二次項A2影響顯著. 影響得率的大小順序為提取溫度>提取時間>水料比.

表3 回歸模型的方差分析及回歸系數(shù)的顯著性檢驗

2.2.3 響應面的曲面分析

圖4～圖6直觀地給出了各因素交互作用對羊肚菌多糖提取率影響的響應面分析圖和等高線分析圖. 響應面的坡度越大說明該因素對多糖得率影響越大，橢圓形的等高線圖說明兩因素之間交互作用顯著，圓形說明交互作用不顯著[13].

圖4 提取溫度與水料比的相互影響及等高線分析圖

由圖4可知，響應面的坡度較大，表明提取溫度與水料比的交互作用對羊肚菌多糖得率影響較大. 從等高線形狀可以看出，提取溫度對多糖得率的影響要大于水料比. 由圖5可知，響應面的坡度較大，表明提取時間與水料比的交互作用對羊肚菌多糖得率影響較大. 從等高線形狀可以看出提取時間對多糖得率的影響要大于水料比. 由圖6可知，響應面的坡度較大，表明提取時間與提取溫度的交互作用對羊肚菌多糖得率影響較大. 從等高線形狀可以看出提取溫度對多糖得率的影響要大于提取時間. 由圖4～圖6可以看出，水料比在(45∶1)～(55∶1)(mL/g)，提取溫度在40～50 ℃，提取時間在3～4 h時，羊肚菌多糖得率達到最大值.

圖5 提取時間與水料比的相互影響及等高線分析圖

圖6 提取時間與提取溫度的相互影響及等高線分析圖

2.2.4 確定最優(yōu)值和回歸模型的驗證實驗

通過Design-Expert 10.0.4.0軟件分析得出，羊肚菌多糖提取的最佳條件為水料比51.21∶1(mL/g)、提取溫度45.865 ℃、提取時間3.459 h，在此條件下預測多糖得率為 7.311 %. 綜合考慮，將提取條件修正為水料比51∶1(mL/g)、提取溫度46 ℃、提取時間3.5 h，在此條件下重復三次，多糖得率穩(wěn)定在(7.39±0.21)%，與預測值基本一致，模型可靠，具有實際應用價值.

3 結論與討論

本實驗以羊肚菌子實體為原料，熱水浸提羊肚菌多糖后直接測定多糖含量，通過單因素實驗和響應面分析法相結合優(yōu)化提取參數(shù)，結果確定最優(yōu)提取條件為：水料比51∶1(mL/g)、提取時間3.5h、提取溫度46℃. 在此優(yōu)化條件下，多糖實際得率為(7.39±0.21)%，實驗結果有很好的重復性，說明利用響應面設計實驗來優(yōu)化羊肚菌多糖熱水浸提工藝是可行的.

任嘉興等[16]對野生羊肚菌多糖提取工藝優(yōu)化的研究結果顯示，優(yōu)化后的提取溫度在88 ℃，而此研究結果提取溫度為46 ℃. 這表明不同品種的羊肚菌，其所含的多糖對溫度敏感性差異較大，同時也表明羊肚菌多糖種類的差異性. 范三紅等[12]開展酶法結合超聲波輔助提取羊肚菌多糖的研究，結果多糖實際得率為7.79%. 周益帆等[17]報道了堿提取羊肚菌多糖的工藝，多糖的得率達到5.39%. 韓融冰等[9]報道了羊肚菌深層發(fā)酵液中多糖的提取工藝. 以上這些均采用了不同的方法和工藝對來源于羊肚菌或其發(fā)酵液中的多糖提取進行研究，說明這些工藝在不同程度上能夠獲得多糖.