李劍梅，馮 敏，謝存一，柴林山，朱萬芹，張疏雨

(遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧 朝陽 122000)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris(Vuill.)Fr.)也稱北蟲草,屬于子囊菌亞門(Ascomycotina)麥角菌科(Clavicepitaceae)蟲草屬(Cordyceps)，是我國一種兼具食用和藥用珍貴價值的優(yōu)質(zhì)大型真菌[1-3]。經(jīng)研究證實(shí)，其化學(xué)成分與冬蟲夏草相近，含有蟲草素、蟲草酸、氧化物歧化酶(SOD)、噴司他丁、麥角甾醇等生物活性物質(zhì)及蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素及鈣、錳、鋅、硒等微量元素，具有滋補(bǔ)營養(yǎng)、增強(qiáng)免疫及抗腫瘤、抑制病毒、抗輻射、抗菌消炎等多種營養(yǎng)、保健及藥用功能[4-8]。蛹蟲草是目前公認(rèn)的食藥用蟲草之一，在我國已經(jīng)形成了一個巨大的產(chǎn)業(yè)，年產(chǎn)值可達(dá)100億元人民幣[9],栽培品種主要有尖頭蛹蟲草、大圓頭蛹蟲草。其中，大圓頭蛹蟲草因子實(shí)體頂端膨大、呈蝌蚪狀而得名，具有色澤金黃、子囊孢子豐富、口感鮮脆、香味濃郁等特點(diǎn)，深受廣大消費(fèi)者喜愛，在我國內(nèi)蒙古赤峰等大部分地區(qū)廣泛栽培。菌種退化是菌類栽培過程中普遍存在的問題，蛹蟲草菌株在繼代培養(yǎng)和保藏的過程中容易退化[8-9]。大圓頭蛹蟲草是通過人工馴化及科學(xué)管理而獲得的栽培品種，菌種容易變異和退化，保存期短，已成為其規(guī)?；斯ぴ耘嚓P(guān)鍵技術(shù)瓶頸之一。菌種質(zhì)量是蛹蟲草人工栽培成敗的前提條件，研究和建立科學(xué)有效的優(yōu)良母種選育方法，選育、保持大圓頭蛹蟲草優(yōu)良菌種性能，對大圓頭蛹蟲草規(guī)?；a(chǎn)具有重要意義。研究表明，組織分離法是一種常用食用菌菌種繁殖方法，具有操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[10]。本研究從生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，采用組織分離方法，對不同組織分離期的大圓頭蛹蟲草菌種性能進(jìn)行了比較試驗(yàn)研究，明確其組織分離最佳時期，為提高大圓頭蛹蟲草人工栽培用優(yōu)良生產(chǎn)母種篩選效率，提升菌種質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 大圓頭蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)不同生長發(fā)育時期子實(shí)體，由遼寧省微生物科學(xué)研究院藥用蕈菌研究室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①PDA加富培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，MgSO40.5 g，KH2PO41 g，瓊脂16 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 6.5，121 ℃保持15 min；②液體種子培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，MgSO40.5 g，KH2PO41 g，瓊脂16 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 6.5，121 ℃保持15 min；③人工栽培培養(yǎng)基：以650 mL罐頭瓶為培養(yǎng)容器，每瓶裝培養(yǎng)料40 g(小麥∶豆粕=8∶1)，按照1∶1.7(g/mL)的比例添加營養(yǎng)液(葡萄糖10 g, MgSO41 g,KH2PO42 g，蛋白胨5 g,VB15 mg，配制成1 000 mL溶液，pH自然)，用聚丙烯塑料膜包裹瓶口，再用橡皮筋扎緊，121 ℃保持1 h。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 立式壓力蒸汽消毒器(LDZX-75KBS，上海申安醫(yī)療器械廠)；超凈工作臺(SW-CJ-2，江蘇蘇靜儀器儀表有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-PZ72，上海一恒科技有限公司)；生物顯微鏡(CKX41，OLYMPUS日本)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)用子代母種組織分離 選取培養(yǎng)時間分別為35 d(無有性孢子期)、40 d(子囊殼形成初期)、45 d(子囊孢子形成初期)、50 d(子囊孢子成熟期)發(fā)育良好、生長健壯、無污染的大圓頭蛹蟲草新鮮子實(shí)體，用75%酒精對培養(yǎng)瓶表面進(jìn)行消毒，無菌打開栽培瓶的封口膜，取出供試新鮮子實(shí)體于無菌培養(yǎng)皿中，用無菌手術(shù)刀取子實(shí)體頭部膨大部分，去除表皮并無菌切成0.2 cm的小段，用接種針接入預(yù)先制備好的PDA加富平板培養(yǎng)基上，18 ℃恒溫、避光培養(yǎng)，當(dāng)組織塊在培養(yǎng)基上形成直徑1.5 cm菌落時，挑取生長健壯的菌落邊緣菌絲于預(yù)先制備好的PDA斜面培養(yǎng)基上，每個組織分離期制備純化菌株25株，18 ℃避光、恒溫培養(yǎng)至菌絲長至1/2斜面，獲得實(shí)驗(yàn)用子代母種，備用。

1.2.2 不同組織分離期對子代母種菌絲生長性狀的影響 無菌挑取2 mm2大小的實(shí)驗(yàn)用子代母種新鮮菌種塊，分別接種于PDA加富平板培養(yǎng)基上，18 ℃避光、恒溫培養(yǎng)，依次觀察各組母種菌絲色澤、長勢、轉(zhuǎn)色、生長速度等情況，對各組供試菌株菌絲生長性狀優(yōu)良率進(jìn)行差異化分析，考察不同組織分離期對子代母種菌絲生長性狀的影響。各組子代母種優(yōu)良率(%)=(生長性狀優(yōu)良菌株數(shù)/子代母種總數(shù)(25))×100%。

1.2.3 不同組織分離期對子代母種液體培養(yǎng)性狀的影響 另取上述各母種，無菌挑取1 mm2大小的菌種塊3～4塊，轉(zhuǎn)接至裝有100 mL液體培養(yǎng)基的 500 mL三角瓶內(nèi)，18 ℃、140 r/min，避光培養(yǎng)4 d，以菌球及發(fā)酵液表觀形態(tài)、生物量為考核指標(biāo)，計算各組供試菌株菌種優(yōu)良率，考察不同組織分離期對子代母種液體菌種培養(yǎng)性狀的影響。生物量測定采用恒重稱量法，即將培養(yǎng)好的液體菌種經(jīng)紗布過濾，然后用適量的蒸餾水洗滌3次，收集菌絲體置于已知重量的稱量瓶中，105 ℃烘干至恒重，稱量，按照下式計算生物量(以每100 mL發(fā)酵液中菌絲體干重表示)。

式中：W1為菌絲體與稱量瓶質(zhì)量和(g)；W0為稱量瓶質(zhì)量(g)；V為發(fā)酵液體積(mL)。

1.2.4 在麥粒培養(yǎng)基上各子代母種菌絲培養(yǎng)性狀及子實(shí)體形成能力的比較 取培養(yǎng)好的子代母種的液體菌種，分別無菌噴灑于栽培培養(yǎng)基料面上，置于人工氣候室18 ℃、避光、空氣相對濕度不低于35%環(huán)境條件下培養(yǎng)15 d左右，當(dāng)培養(yǎng)基表面形成菌絲被，且菌絲被表面有明顯龜被紋時，搔菌轉(zhuǎn)色，24 h給予300 lx的光照，20 ℃、空氣相對濕度不低于50%、二氧化碳濃度低于0.5%條件下培養(yǎng)3～4 d，誘導(dǎo)原基形成；當(dāng)搔菌溝內(nèi)現(xiàn)淡黃色原基時，用接種針在封口膜上扎眼通氣(扎兩排孔，每排扎3個直徑約0.2 mm的小孔)，繼續(xù)培養(yǎng)至60～65 d，子實(shí)體頭部膨大呈球形且著生豐富的子囊殼，表明子實(shí)體已經(jīng)成熟，即可獲得子代母種子實(shí)體。在子實(shí)體培養(yǎng)過程中，觀察比較各組子代母種在栽培培養(yǎng)基上菌絲長勢、菌絲被表觀形態(tài)、轉(zhuǎn)色能力、子實(shí)體形態(tài)、產(chǎn)量及比例，對不同組織分離期子代母種在麥粒培養(yǎng)基上培養(yǎng)性狀及子實(shí)體形成能力進(jìn)行比較分析。子實(shí)體產(chǎn)率計算方法：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組織分離期對子代母種菌絲生長性狀的影響

結(jié)果表明，試驗(yàn)范圍內(nèi)，在PDA加富平板培養(yǎng)基上，組織分離期為35、50 d的子代母種生長速度明顯低于對照母種，在菌絲長勢及轉(zhuǎn)色能力方面，菌種優(yōu)良率較低，與組織分離期為40、45 d的子代母種相比，形成了明顯差異。以40、45 d子實(shí)體為分離材料所獲得的子代母種生長速度、菌絲長勢與對照母種最為相近，絕大多數(shù)菌株菌絲健壯、濃密且爬壁能力、轉(zhuǎn)色能力較強(qiáng)，菌種優(yōu)良率達(dá)到90%以上；其中以組織分離期40 d的子代母種菌絲生長速度最快(3.187 mm/d)，菌絲健壯、濃密、匍匐狀，轉(zhuǎn)色均勻、淡黃，菌種優(yōu)良率最高，除1株子代母種菌絲長勢弱外，其余菌株具有與對照母種相近的良好生長性狀，菌種優(yōu)良率達(dá)到96%。由此可見，不同組織分離期對子代母種在斜面培養(yǎng)基上生長性能具有一定的影響，組織分離期為40 d的子代母種較好地保持和遺傳了對照母種的生長性能。這主要是由于該時期子實(shí)體頭部形成豐富的子囊殼，處于子囊孢子形成早期，菌絲體細(xì)胞處于分化能力最強(qiáng)及活力最高時期，在該時期進(jìn)行組織分離得到的母種活力及長勢最好(表1)。

表1 不同組織分離期制備的母種在斜面培養(yǎng)基上的生長性能比較

2.2 不同組織分離期對子代母種液體培養(yǎng)性狀的影響

液體菌種的培養(yǎng)是蛹蟲草人工栽培的重要環(huán)節(jié)，蛹蟲草液體菌種長勢是子實(shí)體培養(yǎng)成敗的前提條件。試驗(yàn)以母種為對照，對不同組織分離期獲得的子代母種液體培養(yǎng)性狀進(jìn)行了差異化比較試驗(yàn)。結(jié)果表明，不同組織分離期的子代母種液體菌種培養(yǎng)性狀分化程度存在一定的差異；其中35 d組織分離期子代母種液體菌種培養(yǎng)性狀分化明顯，液體菌種優(yōu)良率僅為76%，45、50 d組織分離期子代液體菌種優(yōu)良率分別為88%、84%，40 d組織分離期子代母種液體菌種培養(yǎng)性狀一致性最好，90%以上的子代母種生物量(≥3.1%)高于對照母種(3.1%)，且其液體菌種培養(yǎng)性狀與對照母種相同，菌球較細(xì)密均勻、菌液黏稠；結(jié)果表明，各子代母種液體培養(yǎng)性狀優(yōu)良率差異與其在PDA加富平板培養(yǎng)基上菌絲生長性能差異基本一致，二者明顯正相關(guān)，這主要是由于蛹蟲草菌株在適宜的液體培養(yǎng)條件下，優(yōu)良子代母種的菌絲生命力旺盛、生長迅速，且組織分離法為無性繁殖，不易產(chǎn)生遺傳物質(zhì)變異，其子代母種菌絲優(yōu)良的培養(yǎng)性狀得到穩(wěn)定遺傳(表2)。

表2 不同組織分離期子代母種液體培養(yǎng)性狀的比較

2.3 麥粒培養(yǎng)基上各子代母種培養(yǎng)性狀及子實(shí)體形成能力比較

栽培試驗(yàn)是全面檢驗(yàn)菌種性能的根本方法,出草情況是菌種綜合性能的全面反映[7]。在大圓頭蛹蟲草實(shí)際生產(chǎn)過程中，在麥粒培養(yǎng)基上，優(yōu)良的大圓頭蛹蟲草菌種菌絲長勢旺盛，形成厚0.5～1.0 cm的菌絲被，在適宜條件下，避光培養(yǎng)15 d，菌絲扭結(jié)形成典型的龜背紋，見光后菌絲轉(zhuǎn)色成均勻的淡黃色，子實(shí)體通體金黃，頭部膨大呈球形，子實(shí)體蝌蚪狀，且密度適中，整齊一致(圖1)。

圖1 大圓頭蛹蟲草優(yōu)良母種在麥粒培養(yǎng)基上的長勢

栽培試驗(yàn)結(jié)果(表3、表4)表明：組織分離期為40 d的子代母種培養(yǎng)性狀表現(xiàn)最優(yōu)，45 d次之，50 d最差。組織分離期為40 d的子代母種中，92%子代母種與對照母種菌絲長勢相近，菌絲長勢旺盛，菌絲被較厚，84%的子代母種在菌絲被表面形成典型龜背紋，見光轉(zhuǎn)色迅速、均勻，子代母種培養(yǎng)性狀優(yōu)良率達(dá)到了84%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還說明：試驗(yàn)菌株子實(shí)體形成能力與菌種培養(yǎng)性狀表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性，組織分離期40 d的子代母種優(yōu)良菌株篩選率最高(48%)；45 d次之(44%)，50 d最低(32%)；并且在各組子代母種中，以菌絲長勢旺盛、菌絲被較厚的各組子代母種子實(shí)體形成能力表現(xiàn)最優(yōu)，多數(shù)菌株與對照母種相似，在菌絲被表面形成典型的龜背紋，見光后菌絲迅速轉(zhuǎn)色成均勻的淡黃色，形成的子實(shí)體商品性狀良好；菌絲長勢極旺盛、菌絲被厚的子代母種則分化明顯，多數(shù)菌株菌絲氣生性強(qiáng)、菌絲被厚且無龜背紋、轉(zhuǎn)色不均一或不轉(zhuǎn)色，子實(shí)體形成能力也較弱；而菌絲長勢弱、菌絲被薄的試驗(yàn)菌株均無典型的龜背紋，轉(zhuǎn)色能力及子實(shí)體形成能力差，不能形成正常子實(shí)體。菌種分化主要是由于蛹蟲草菌株具有較強(qiáng)的遺傳不穩(wěn)定性，在菌種分離及人工培養(yǎng)過程中，部分菌株由于營養(yǎng)條件、環(huán)境條件等方面的影響，造成可育性控制基因丟失，出現(xiàn)菌絲徒長、敗育等現(xiàn)象。綜合各組子代母種在栽培實(shí)驗(yàn)中菌種性能表現(xiàn)，以組織分離期為40 d的子代母種性能最優(yōu)，這一結(jié)果與各組子代母種菌絲生長性狀及液體培養(yǎng)性狀考察結(jié)果一致。因此，大圓頭蛹蟲草菌種組織分離最佳分離期為40 d。

表3 不同組織分離期子代母種在麥粒栽培培養(yǎng)基上培養(yǎng)性狀的比較

表4 不同組織分離期子代母種在麥粒栽培培養(yǎng)基上子實(shí)體生長情況的比較

3 討 論

組織分離法可較好地保持和遺傳母種的優(yōu)良性狀，且操作較為簡便，遺傳變異性較低，是大圓頭蛹蟲草母種篩選及復(fù)壯的重要手段之一。試驗(yàn)通過對不同組織分離期(35、40、45、50 d)子代母種平板培養(yǎng)、液體培養(yǎng)及栽培實(shí)驗(yàn)，對不同組織分離期子代母種性能進(jìn)行了科學(xué)評價，綜合各組子代母種在PDA加富平板培養(yǎng)基的菌絲生長性狀、液體培養(yǎng)性狀及栽培實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果，以40 d子代母種優(yōu)良菌種篩選率最高(48%)，45 d次之(44%)，50 d最低(32%)，明確了大圓頭蛹蟲草菌種組織分離最佳分離期為40 d。

相關(guān)研究證明，蛹蟲草菌種特別容易退化，一般經(jīng)過一段時間保藏或傳代，其菌種性能可發(fā)生嚴(yán)重衰退，產(chǎn)量及活性物質(zhì)含量顯著降低，甚至不轉(zhuǎn)色、不形成子實(shí)體，需經(jīng)常對菌種進(jìn)行復(fù)壯或選育[14-15]。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，大圓頭蛹蟲草子代母種子實(shí)體形成能力與其培養(yǎng)性狀具有顯著相關(guān)性，且優(yōu)良的子代母種具有與試驗(yàn)對照母種相近的培養(yǎng)性狀，在PDA加富培養(yǎng)基上菌絲健壯、濃密、爬壁能力強(qiáng)、轉(zhuǎn)色均一，液體培養(yǎng)條件下菌球細(xì)密、黏度適中，在麥粒培養(yǎng)基上可形成厚度適中的菌絲被，并形成典型的龜背紋，見光后轉(zhuǎn)色迅速均勻，子實(shí)體整齊、形態(tài)好、產(chǎn)量高。因此，在大圓頭蛹蟲草菌種選育、復(fù)壯過程中，可依據(jù)優(yōu)良子代母種在各培養(yǎng)時期的培養(yǎng)特性，對所獲子代母種性能進(jìn)行預(yù)判，淘汰可育性較差的菌株，進(jìn)而減少工作量，提高菌種選育效率。試驗(yàn)結(jié)果可為大圓頭蛹蟲草優(yōu)良菌種選育、復(fù)壯提供參考。