王立君 韓俊先 華永芬 王晨晨 李星輝 謝萍

大氣顆粒污染物與心血管系統(tǒng)疾病的相關(guān)性近年來受到關(guān)注。PM2.5是粒徑≤2.5 μm的顆粒和液滴，是常見的大氣污染物。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5水平與心血管疾病死亡有一定聯(lián)系[1]。PM2.5會引起炎性反應并加速動脈粥樣硬化，影響血管功能，引發(fā)心血管疾病?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)為含鋅內(nèi)肽酶家族，可以調(diào)節(jié)血管細胞外基質(zhì)(ECM)的降解，參與動脈硬化斑塊產(chǎn)生和破裂[2-3]。MMP-2和MMP-9為降解彈性膠原的主要成分，與平滑肌細胞遷移和增殖密切相關(guān)，可促進動脈硬化發(fā)生發(fā)展[4]?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)是體內(nèi)MMP的天然特異性抑制劑，它可通過共價鍵與MMP結(jié)合，并與MMP共同維持ECM的動態(tài)平衡。ECM動態(tài)平衡的破壞可促進動脈粥樣硬化斑塊的形成和破裂[5-7]。本研究旨在建立沙塵暴PM2.5暴露模型，探討PM2.5對MMP-2、MMP-9及TIMP表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 PM2.5收集及PM2.5溶液的配制

2018年4月沙塵暴頻發(fā)，在河西走廊非工業(yè)區(qū)使用EOM1405D雙通道顆粒物監(jiān)測儀采集沙塵顆粒，PM2.5來自系統(tǒng)可更換的TEOM濾膜。將濾膜裁剪成1 cm×3 cm小片，放入超純水中，超聲下震蕩處理0.5 h，共3次。震蕩液經(jīng)紗布過濾，所得濾液在冷凍后進行真空干燥處理，獲得PM2.5粉末，置入-20 ℃冰箱保存。使用無菌生理鹽水配制PM2.5溶液，配制時精確稱量PM2.5粉末量，超聲處理15 min進行混勻。

1.2 沙塵暴PM2.5 暴露模型的建立

將36只雄性6周齡ApoE基因敲除小鼠隨機分為對照組、PM2.5低劑量暴露組、PM2.5中劑量暴露組、PM2.5高劑量暴露組，測量小鼠心率、體質(zhì)量、體溫等指標。10%水合氯醛麻醉小鼠，仰臥位固定，消毒處理后在頸前正中切口，切口長度約1 cm，組織分離后暴露氣管，刺入針頭后滴入PM2.5溶液，PM2.5低、中、高劑量暴露組的PM2.5溶液濃度分別為1.6、8.0、40.0 mg/L，滴入量為0.15 mL/100 g，對照組注入生理鹽水，注入量為0.15 mL/100 g，每日滴注1次。飼養(yǎng)20周后脫頸椎處死小鼠，獲取心臟組織，-80 ℃低溫保存。

1.3 Westernblot檢測MMP-2、MMP-9和TIMP的蛋白表達水平

RIPA緩沖液裂解蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。蛋白經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，5%脫脂乳室溫封閉2 h，MMP-2、MMP-9、TIMP一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，ECL染色后，于凝膠成像儀中成像。通過ImageJ軟件對條帶進行灰度值分析，計算蛋白相對表達水平。

1.4 實時聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測MMP-2、MMP-9和TIMP的mRNA表達水平

Trizol法提取RNA，紫外分析儀檢測RNA濃度。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進行SYBR Green熒光定量RT-PCR。MMP-2引物序列：上游5′-CAACGGTCGGGAATACAGCA-3′，下游5′-TGGTAAACAAGGCTTCATGGG-3′。MMP-9引物序列：上游5′-TGGTCTTGGAACAGGAGCAAA-3′，下游5′-ACATTCAGTGGTCTCAGCCTTT-3′。TIMP引物序列：上游5′-CTGGCATCTGGCATCCTCTT-3′，下游5′-GGGAACCCATGAATTTAGCCC-3′。PCR反應條件：95 ℃初始變性5 min，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間差異比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心肌細胞MMP-2的表達水平比較

4組MMP-2的mRNA及蛋白表達水平均有統(tǒng)計學差異(P均<0.05)。兩組間比較，PM2.5低劑量暴露組MMP-2的mRNA及蛋白表達水平明顯高于對照組，PM2.5中劑量暴露組MMP-2的mRNA及蛋白表達水平明顯高于PM2.5低劑量暴露組，PM2.5高劑量暴露組MMP-2的mRNA及蛋白表達水平明顯高于PM2.5中劑量暴露組(P均<0.05)，見表1。

表1 各組小鼠心肌細胞MMP-2的表達水平比較

2.2 各組小鼠心肌細胞MMP-9的表達水平比較

4組MMP-9的mRNA及蛋白表達水平均有統(tǒng)計學差異(P均<0.05)。兩組間比較，PM2.5低劑量暴露組MMP-9的mRNA及蛋白表達水平明顯高于對照組，PM2.5中劑量暴露組MMP-9的mRNA及蛋白表達水平明顯高于PM2.5低劑量暴露組，PM2.5高劑量暴露組MMP-9的mRNA及蛋白表達水平明顯高于PM2.5中劑量暴露組(P均<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠心肌細胞MMP-9的表達水平比較

2.3 各組小鼠心肌細胞TIMP的表達水平比較

4組TIMP的mRNA及蛋白表達水平均有統(tǒng)計學差異(P均<0.05)。兩組間比較，PM2.5低劑量暴露組TIMP的mRNA及蛋白表達水平明顯低于PM2.5對照組，PM2.5中劑量暴露組TIMP的mRNA及蛋白表達水平明顯低于PM2.5低劑量暴露組，PM2.5高劑量暴露組TIMP的mRNA及蛋白表達水平明顯低于PM2.5中劑量暴露組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠心肌細胞TIMP的表達水平比較

3 討論

近年來，大氣顆粒物污染有所加重，威脅人類健康。統(tǒng)計研究發(fā)現(xiàn)，在沙塵暴高發(fā)時期，受沙塵暴影響區(qū)域醫(yī)院心血管疾病就診人數(shù)大幅度增加，死亡率也明顯升高[8]。大氣顆粒物污染的相關(guān)研究主要針對呼吸系統(tǒng)毒性方面，較少針對心血管系統(tǒng)。

長期高濃度PM2.5暴露易引發(fā)血管內(nèi)皮細胞損傷[9]，而內(nèi)皮細胞損傷與動脈粥樣硬化密切相關(guān)。血管內(nèi)皮屏障相關(guān)的功能物質(zhì)為ECM，ECM代謝平衡的打破會導致血管重構(gòu)，顯著增加動脈粥樣硬化風險。MMP可通過特殊類型的連接蛋白結(jié)合ECM，進而降解ECM，在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[10]。TIMP屬于MMP的特異性抑制劑，可通過氨基端功能區(qū)的半胱氨酸殘基結(jié)合活化的MMP，形成MMP-TIMP復合體，從而阻斷MMP與底物的結(jié)合[11]。MMP與內(nèi)源性抑制劑相互協(xié)同，調(diào)節(jié)細胞活化、增殖、遷移、凋亡、血管生成以及心肌ECM的動態(tài)平衡[12-13]。研究表明，小鼠血管內(nèi)膜損傷時，MMP-2和MMP-9表達水平升高[14-15]，提示MMP可促進內(nèi)膜增厚并加速血管平滑肌細胞遷移。在MMP-9缺失時，小鼠內(nèi)膜細胞的生成也會出現(xiàn)異常或延遲。

MMP及其抑制劑TIMP是反映動脈粥樣硬化進程的重要標志物，本研究主要分析暴露于不同濃度PM2.5時，MMP及TIMP表達的變化情況，以闡述ECM失衡對動脈粥樣硬化疾病發(fā)生發(fā)展的影響及機制。結(jié)果顯示，暴露于PM2.5的小鼠心肌細胞中MMP-2、MMP-9的表達水平高于正常小鼠，TIMP的表達水平低于正常小鼠，且MMP-2、MMP-9的表達水平隨小鼠PM2.5暴露濃度的增高呈上升趨勢，TIMP的表達水平隨小鼠PM2.5暴露濃度的增高呈下降趨勢。研究結(jié)果提示暴露于PM2.5可以促進小鼠心肌細胞中MMP-2、MMP-9的表達，沙塵顆粒物濃度越高，小鼠動脈粥樣硬化程度可能越重。

動脈粥樣硬化是長期復雜的病變過程，影響因素較多。在甘肅河西走廊等沙塵暴高發(fā)地區(qū)進行冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)防治時，可以在減少大氣顆粒物控制環(huán)境污染的同時，分析患者的MMP-2、MMP-9及TIMP表達水平，以深入探討與ECM動態(tài)平衡破壞相關(guān)的冠心病的發(fā)病機制。