展望韓 偉 莊緒會 鄒海杰 孫 博 陳紅娟 苗海江 羅曉宏 謝嫣琪

(國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院，北京 100037)

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption ionization time of fight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)技術(shù),是20世紀(jì)后期發(fā)展起來的一種新型“軟電離”質(zhì)譜技術(shù),廣泛用在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測及食品檢測等多領(lǐng)域。MALDI-TOF MS是基質(zhì)輔助激光解吸離子源和飛行時間質(zhì)譜的串聯(lián)體，它不產(chǎn)生或者產(chǎn)生很少的碎片離子，使不揮發(fā)性與熱不穩(wěn)定性的生物大分子和高分子聚合物的檢測成為可能[1，2]；這主要得益于MALDI的特點，即準(zhǔn)分子離子峰很強(qiáng)，幾乎無碎片離子，因此可直接分析蛋白質(zhì)酶解后產(chǎn)生的多肽混合物[3]。在MALDI-TOF MS的諸多應(yīng)用中，微生物快速檢測即是基于微生物表面蛋白分子量檢測而實現(xiàn)的[4，5]。

在糧食及油料種子的收獲、儲存、運(yùn)輸、銷售及其食品加工過程中，微生物是無處不在的，主要包括的微生物類群：細(xì)菌類中的真細(xì)菌和放線菌，真菌類中的霉菌、酵母菌和病原真菌等[6，7]。有研究以小麥和玉米為研究對象，分析測定糧食儲藏前以及儲藏過程中微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)在小麥內(nèi)部單端孢霉(Trichodermamonocytogenes)，灰綠曲霉(Aspergillusglaucus)、節(jié)菱孢霉(Arthrosporium)均有檢出，小麥外部分布著單端孢霉屬(Trichothecium)，鐮刀霉屬(Fusarium)，木霉屬(Trichoderma)，頭孢霉屬(Cephalosporium)，交鏈孢霉屬(Alternaria)和曲霉屬(Aspergillus)；同時，短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)，地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)等細(xì)菌也被培養(yǎng)法檢出[8]。張秀宇等[9]匯總了全國2016—2019年糧食加工品國家食品安全監(jiān)督抽檢結(jié)果，對不合格項目信息進(jìn)行分類統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)不合格項次中微生物原因占比32.86%，真菌毒素占比20.31%。因此，糧油及其食品樣品中所涵蓋微生物的復(fù)雜且多樣，必然要求準(zhǔn)確性高、鑒定速度快、能實現(xiàn)高通量的鑒定技術(shù)儲備。

本文綜述了MALDI-TOF MS技術(shù)在微生物鑒定原理、鑒定細(xì)菌與真菌的應(yīng)用實踐以及影響因素等方面的最新研究進(jìn)展，詳細(xì)闡述MALDI-TOF MS技術(shù)的優(yōu)越性同時，展望了它在糧油與食品微生物鑒定中的應(yīng)用潛力。

1 MALDI-TOF MS技術(shù)的原理

MALDI-TOF MS技術(shù)的基本原理是：MS用來檢測m/z(質(zhì)荷比)，MALDI是軟電離技術(shù)，基質(zhì)從紫外線激光吸收能量，以最小的碎片從大分子中產(chǎn)生離子，而TOF是質(zhì)量分析器，m/z比可以由離子的飛行時間來確定，隨后計算出離子質(zhì)量[2]。

對于微生物鑒定來說，經(jīng)過樣品準(zhǔn)備、質(zhì)譜分析、數(shù)據(jù)庫比對等步驟最終得到鑒定結(jié)果。α-氰基-4-羥基肉桂酸(a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA)和2,5-二羥基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid)常用于MALDI樣品的制備中。m/z為2 000～20 000的多肽或蛋白質(zhì)常被用于分析。不同微生物核蛋白的序列和長度等都不同且高度保守，因此，純菌株的一系列質(zhì)譜峰亦有其獨特性[10-12]。故以蛋白質(zhì)為靶標(biāo)分子，微生物的質(zhì)量圖譜與已知質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫中的特征性質(zhì)譜圖比對，篩選并確定出特異性圖譜，達(dá)到對目標(biāo)微生物的檢測。在商業(yè)化軟件中，未知微生物圖譜與數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行比較，可以鑒定到細(xì)菌的屬、種、甚至亞種[13]。鑒定依據(jù)主要有幾點：微生物的特異性指紋圖譜之間的差異性；特征性生物分子提供的模式峰，用于屬、種、株系鑒定；高通量微生物鑒定系統(tǒng)可自動化分析特異性指紋圖譜；樣品的指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行匹配，依照分值對鑒定結(jié)果進(jìn)行分級和歸類[14]。

2 MALDI-TOF MS技術(shù)在微生物鑒定中的影響因素

2.1 MALDI-TOF MS技術(shù)與其他鑒定技術(shù)比較

微生物鑒定通常包含形態(tài)水平、生化水平、基因水平和蛋白水平，常用方法如菌形與菌落分析、生理生化試驗、脂肪酸分析、拉曼光譜法、保守基因檢測、基因雜交及MALDI-TOF MS方法等[15-17]。在現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)中，糧油與食品微生物多以形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)或/和保守基因為基礎(chǔ)進(jìn)行鑒定。

龔艷清[18]等對比MALDI-TOF MS與傳統(tǒng)的生化鑒定方法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法鑒定不同株李斯特菌的結(jié)果，驗證了MALDI-TOF MS方法的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。李慧等[19]結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、16S rRNA基因分析及MALDI-TOF MS等三種技術(shù)分離并鑒定微生物，研究了土豆燒牛肉方便菜肴產(chǎn)品的脹袋問題。Marta等[20]對比了16S rDNA限制性酶切片段多樣性和MALDI-TOF MS方法、對80株乳桿菌完成鑒定，并認(rèn)為兩種方法都是有效的鑒定工具。Kazuyuk等[21]同樣對比了16S rRNA基因分析與MALDI-TOF MS方法，MALDI-TOF MS鑒定到種和屬的準(zhǔn)確率分別為91.7%(429/468)和97.0%(454/468)。以上結(jié)果表明，與傳統(tǒng)鑒定方法比較，基于蛋白水平檢測的MALDI-TOF MS方法同樣具有很高的準(zhǔn)確率和復(fù)現(xiàn)性。

2.2 基于MALDI-TOF MS技術(shù)的設(shè)備比較

目前，市場上可選擇的、成熟的MALDI-TOF MS鑒定系統(tǒng)不多，不同質(zhì)譜系統(tǒng)得到的鑒定結(jié)果也不盡相同。Li等[22]對比VITEK MS和MALDI biotyper system鑒定，準(zhǔn)確率分別為90%和86%。李艷君等[23]對比MALDI-TOF MS、VITEK MS微生物鑒定系統(tǒng)和顯色培養(yǎng)法，鑒定206株酵母菌，準(zhǔn)確率分別是：VITEK MS鑒定儀為82.5%，顯色培養(yǎng)法為67.0%，MALDI-TOF MS 為92.7%。王偉[24]使用VITEK MS和 MALDI 7090TMMALDI-TOF/TOF MS對比分析40株標(biāo)準(zhǔn)菌株和18 株阪崎克羅諾桿菌(Cronobactersakazakii)野生菌株，兩者特征峰的出峰位置和相對峰強(qiáng)度無明顯差異。

2.3 其他因素

在MALDI-TOF MS鑒定過程中，除設(shè)備類型外，微生物的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件、樣品處理方式、試劑及濃度、靶點涂布均勻性、菌種特異峰及峰值數(shù)量等因素也是影響鑒定結(jié)果的重要原因。

不同培養(yǎng)基(哥倫比亞血瓊脂、沙氏瓊脂和念珠菌顯色瓊脂)和甲酸濃度(60%～90%)對MALDI-TOF MS鑒定白假絲酵母菌(Candidaalbicans)結(jié)果有不同程度的影響；在血瓊脂培養(yǎng)基和沙氏瓊脂培養(yǎng)基中的白假絲酵母菌、用90%濃度的甲酸處理的結(jié)果無差異[25]。李鳳琴等[26]研究了培養(yǎng)基成分(查氏酵母提取粉瓊脂培養(yǎng)基、麥芽提取粉瓊脂培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基)和培養(yǎng)時間(5、7、10和14 d)對MALDI-TOF MS鑒定真菌的影響及鑒別產(chǎn)毒和非產(chǎn)毒真菌的可能性；發(fā)現(xiàn)CYA、PDA、CA及MA分別是紅曲菌(Monascus)、曲霉屬黃綠組與鐮孢菌屬、曲霉屬黑色組、青霉屬(Penicillium)的最適培養(yǎng)基，最佳培養(yǎng)時間為7 d(MALDI-TOF MS分析而言)，并且黃曲霉產(chǎn)毒株和非產(chǎn)毒株的質(zhì)譜圖不同。對比直接涂布法、甲酸提取法、甲酸-乙腈提取法等方式的鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)甲酸提取法和CHCA基質(zhì)更適合MALDI-TOF MS鑒定[24]。從以上結(jié)果來看，微生物本身的特點及其生存環(huán)境、實驗操作的細(xì)節(jié)與處理決策等，都可能影響到MALDI-TOF MS的鑒定結(jié)果；但影響(屬、種、型的鑒定結(jié)果)程度大小、結(jié)果的一致性與普遍性規(guī)律等仍有賴于大量數(shù)據(jù)的補(bǔ)充和驗證。

3 MALDI-TOF MS技術(shù)在微生物鑒定中的應(yīng)用現(xiàn)狀

3.1 MALDI-TOF MS技術(shù)在細(xì)菌鑒定方面的應(yīng)用

Anhalt等[27]提出了利用質(zhì)譜法分析蛋白，進(jìn)行細(xì)菌鑒定的概念。至今，相關(guān)研究內(nèi)容已涉及細(xì)菌鑒定、細(xì)菌分型、抗生素抗性分析及代謝產(chǎn)物。MALDI-TOF MS已成功應(yīng)用于食品微生物、臨床微生物、養(yǎng)殖病原菌等多個應(yīng)用領(lǐng)域。在糧油微生物方面，目前細(xì)菌檢測沒有足夠的重視和要求。MALDI-TOF MS鑒定在其他領(lǐng)域的應(yīng)用，對于未來糧油微生物檢測，將有很好的借鑒意義。

3.1.1 食品微生物鑒定

范鐵男等[28]以19株已知標(biāo)準(zhǔn)菌株建庫，鑒定分離自人體糞便、泡菜、乳制品等樣品中60株待檢菌株，均能正確地鑒定到屬水平，87.7%的菌株鑒定到種水平。楊祖順等[29]取自不同類食品來源的、共210株金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，采用MALDI-TOF MS對其進(jìn)行鑒定，98.10%的菌株鑒定到種水平。Lucas等[30]利用MALDI-TOF MS成功得到大豆中根瘤菌(Bradyrhizobium)的指紋譜圖。

3.1.2 臨床微生物鑒定

Li等[22]通過meta分析研究了覆蓋6685株厭氧菌的質(zhì)譜法鑒定，得到結(jié)論如下：84%的菌鑒定到種(I2= 98.0%，P<0.1)，92%的菌鑒定到屬(I2=96.6%，P<0.1)，準(zhǔn)確率由高到低分別為：擬桿菌(Bacteroides)、乳桿菌(Lactobacillus)、副擬桿菌(Parabacteroides)、梭菌(Clostridium)等，然而，稀有厭氧菌的準(zhǔn)確率偏低。李進(jìn)等[31]利用MALDI-TOF MS檢測258株金屬酶銅綠假單胞菌(metallo-β-lactamasePseudomonasaeruginosa)，識別VIM型菌株的靈敏度為92.0%、特異性為100.0%，陽性預(yù)測值為100.0%，而SPM型菌株的靈敏度為80.0%，特異性為100.0%，陽性預(yù)測值均為100.0%。沈佳瑾等[32]收集32株大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)和28株肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)，利用MALDI-TOF MS均能快速鑒別耐碳青霉烯類腸桿菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae)。吳思穎等[33]利用MALDI-TOF MS快速鑒定新生隱球菌(Cryptococcusneoformans)和格特隱球菌(C.gattii)，并能夠區(qū)分新生隱球菌和格特隱球菌的不同基因型。

3.1.3 養(yǎng)殖過程中微生物鑒定

徐淑菲等[34]用MALDI-TOF MS檢測進(jìn)口甲魚卵中攜帶病原菌，能夠分離并鑒定出綠膿桿菌(P.aeruginosa)、奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)、肺炎克雷伯氏菌、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、沙門氏菌(Salmonella)等242株致病菌。李楠等[35]分析豬場中分離自空氣的微生物并鑒定，包括芽孢桿菌、微球菌、短桿菌、葡萄球菌在內(nèi)的210株菌，91%被準(zhǔn)確鑒定到種水平，95.7%被準(zhǔn)確鑒定到屬水平。Barcelos等[36]從牛中分離186株可能與乳腺炎相關(guān)的細(xì)菌，對比了兩種提取方法并使用MALDI-TOF MS鑒定。

3.2 MALDI-TOF MS技術(shù)在真菌鑒定方面的應(yīng)用

在糧油與食品領(lǐng)域，真菌及其毒素污染始終是關(guān)乎食品安全的重點。相對于多數(shù)細(xì)菌，真菌對水活度的要求相對低，易在糧油與食品中生長；但真菌的準(zhǔn)確、快速鑒定卻要比細(xì)菌復(fù)雜得多。

3.2.1 酵母菌鑒定

MALDI-TOF MS在真菌領(lǐng)域最早應(yīng)用于鑒定酵母菌，并在常見酵母菌鑒定中有著很高的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性[5]。Elsa等[37]鑒定了8株釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，均準(zhǔn)確地鑒定到種水平。楊丹等[38]評估了真菌顯色培養(yǎng)基及培養(yǎng)時間對假絲酵母菌在MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果中的影響。楊靜等[39]評價外陰陰道假絲酵母菌的鑒定精確性，包括白假絲酵母、非洲假絲酵母(C.africans)、都柏林假絲酵母(C.dublin)、光滑假絲酵母(C.glabrata)、熱帶假絲酵母(C.tropicalis)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、阿薩希絲孢酵母(Trichosporonasahii)等在內(nèi)的314株，正確率為96.91%。張博筠等[40]的結(jié)果顯示質(zhì)譜鑒定酵母菌準(zhǔn)確率為97.7%，而API ID 32C系統(tǒng)鑒定準(zhǔn)確率為93.0%，有顯著差異(χ2=9.439，P=0.002)；MALDI-TOF MS與ITS測序相比并無統(tǒng)計學(xué)差異。

3.2.2 絲狀真菌鑒定

相比酵母菌，絲狀真菌的鑒定顯然更為復(fù)雜，無論傳統(tǒng)方法還是基因測序，對實驗人員知識和技能、時間和成本等都有更高要求，但MALDI-TOF MS鑒定很大程度規(guī)避了前者的缺點，同時達(dá)到很高的準(zhǔn)確率。張偉錚等[41]對臨床分離的254株絲狀真菌完成鑒定，MALDI-TOF MS的總體準(zhǔn)確率為 86.36%，對毛癬菌屬(Trichophyton)、毛孢子菌屬、毛霉菌屬、曲霉菌屬準(zhǔn)確率很高，但對犬小孢子菌(Microsporumcaninum)、鐮刀菌屬、新月彎孢霉(Curvularialunata)準(zhǔn)確率較低。張桂等[42]采用直接涂靶法(質(zhì)譜直涂法)快速鑒定133株絲狀真菌，質(zhì)譜直涂法與另外兩種方法(基因序列分析與形態(tài)學(xué)鑒定)的種、復(fù)合群和屬的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為0.611、0.625、2.728和0.516、0.915、1.206，P>0.05)。吳友偉等[43]以102株絲狀真菌為供試樣品，采用Kappa值方法對質(zhì)譜鑒定與形態(tài)學(xué)方法鑒定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，認(rèn)為MALDI-TOF MS在絲狀真菌鑒定正確性與時效性優(yōu)于形態(tài)學(xué)方法。王慶玲[44]發(fā)現(xiàn)67株絲狀真菌MALDI-TOF MS的鑒定結(jié)果，與形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果基本一致，在屬、種水平鑒定的總一致率分別為98.5%與94.1%，其中，曲霉菌—屬鑒定種水平的一致率達(dá)到100%。

4 結(jié)論與展望

MALDI-TOF MS技術(shù)是微生物快速鑒定的有效方法之一。MALDI-TOF MS技術(shù)與其他鑒定方法相比，原理不盡相同、各有所長，但具有快速、簡便、準(zhǔn)確的優(yōu)點。目前，MALDI-TOF MS技術(shù)亦有其使用極限，比如它還不能區(qū)分志賀氏菌和埃希氏大腸桿菌、百日咳桿菌(Bordetellapertussis)和 支氣管敗血鮑特菌(B.branchiseptica)、木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)和魯蘭無色桿菌(A.ruhlandii)、諾迪擬桿菌(B.nordii)和沙雷伯氏桿菌(B.salyersiae)、6種親緣關(guān)系近的腸桿菌(Enterobacterasburiae,E.cloacae,E.hormaechei,E.kobei,E.ludwigii,andE.nimipressuralis)、不同血清型的沙門氏菌、及蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)與蘇云金芽胞桿菌(B.thuringiensis)和蕈狀芽胞桿菌(B.mycoides)[2，29]。正是由于微生物間相似的遺傳背景或蛋白表達(dá)差異不大等原因，質(zhì)譜信號并不能清晰分辨菌種間差異；加之儀器昂貴、真菌數(shù)據(jù)庫參考菌株少，故MALDI-TOF MS技術(shù)目前還不可能完全替代傳統(tǒng)的微生物鑒定技術(shù)，但它是微生物鑒定中較好的補(bǔ)充方法。

MALDI-TOF MS技術(shù)在糧油與食品微生物快速鑒定中有廣闊的應(yīng)用空間。成熟的微生物鑒定手段和先進(jìn)的鑒定設(shè)備已經(jīng)在各糧油檢驗機(jī)構(gòu)或科研機(jī)構(gòu)普遍使用，但糧油與食品微生物的快速、準(zhǔn)確鑒定方面仍存不足之處。這其中有技術(shù)本身的原因，比如16S rRNA基因測序(全步驟)、Biolog微生物鑒定系統(tǒng)和MIDI全脂肪酸鑒定系統(tǒng)的實際平均用時分別在24、24及2h/樣品，而MALDI-TOF MS平均用時10～20 min/樣品。同時，糧油微生物中絲狀真菌多，區(qū)分產(chǎn)毒菌株和非產(chǎn)毒菌株是快速鑒定的重點，依賴蛋白分析的MALDI-TOF MS技術(shù)可能成為有效的解決手段之一。

MALDI-TOF MS技術(shù)作為近些年已廣泛用于微生物鑒定的新技術(shù)，具有高通量、成本低、精確性高的特點，其結(jié)果的可靠性和精密度已被大量的研究所證明。未來，通過不斷地開發(fā)針對糧油與食品樣品的檢測方法并逐步完善菌株質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，MALDI-TOF MS技術(shù)在糧油與食品微生物的快速鑒定領(lǐng)域必然有更為廣闊的應(yīng)用空間。