廖雪洪，林賢東，潘 超，葉韻斌，陳 剛，林潔瓊，胡 丹，夏 言，鄭雄偉

胃癌是最常見的惡性消化道腫瘤，其發(fā)病率和病死率均較高[1]。胃癌屬于上皮來源腫瘤，由胃上皮細胞及祖細胞不斷克隆增殖形成[2-3]。幽門螺桿菌(helicobacter pylori，HP)、EBV等外界因素引起胃黏膜屏障破壞導致的胃炎，已被證實是最常見“腸型”胃癌的危險因子[4]。目前，胃炎向胃癌進展的機制尚未清楚。胃動蛋白家族(gastrokines, GKN)是一類特異性表達于正常胃黏膜上皮的分泌小蛋白，具有促進胃黏膜上皮細胞分裂增殖和移行、保護胃黏膜和促進受損黏膜修復的功能[5]。胃動蛋白2(gastrokine 2, GKN2)作為GKN的重要成員之一，是胃黏液層的組成成分之一，其與TFF1在胃黏膜表面形成一個異源二聚體復合物，保護胃黏膜和促進受損黏膜修復[5]。近期研究顯示，GKN2在清除HP和抑制胃癌細胞生長中起重要作用。本實驗重點探討GKN2對胃癌細胞生物學功能的影響及可能機制，為臨床與病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑收集2016年福建醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院存檔的8例胃癌及癌旁組織。胃癌細胞株AGS、SGC-7901、MKN45、BGC-823、NCI-N87、MKN28均購自上海細胞庫。F12 HAM'S培養(yǎng)基、RPMI培養(yǎng)基(廈門Hyclone公司)；北美胎牛血清(美國GIBCO公司)；胰蛋白酶(美國Life公司)；RNA提取試劑盒(美國Promega公司)；逆轉錄試劑盒(日本Takara公司)；FastStart Universal SYBR Green Master(美國Roche公司)；實時無標記細胞功能分析檢測板(E-plate16)(福州世豪公司)。

1.2 慢病毒表達系統(tǒng)LVCON238作為陰性對照病毒，過表達慢病毒載體GV358(圖1)，AgeI/AgeI酶切，購自上海吉凱基因公司。

1.3 細胞培養(yǎng)及慢病毒感染胃癌細胞株AGS、SGC-7901采用F12培養(yǎng)基，MKN45、MKN28、BGC-823、NCI-N87采用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，經37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)，2～3天/次。將細胞消化接種于24孔板中，陰性對照組加入LVCON238病毒液2 μL、F12培養(yǎng)液250 μL、增強液250 μL、5 μg polybrene混勻培養(yǎng)；GKN2過表達組加入LV-GKN2病毒液25 μL、F12培養(yǎng)液250 μL、增強液250 μL、5 μg polybrene混勻培養(yǎng)。嘌呤霉素待陽性克隆形成，擴大培養(yǎng)，建立穩(wěn)轉細胞系，分別命名為陰性對照組：AGS-CON、SGC-7901-CON，GKN2過表達組：AGS-GKN2、SGC-7901-GKN2，熒光顯微鏡下觀察細胞熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的表達，qRT-PCR及Western blot法驗證GKN2的表達情況。

圖1 過表達慢病毒載體圖譜

1.4 方法

1.4.1qRT-PCR 收集穩(wěn)轉細胞株，按照Trizol法提取細胞總RNA。取1 μg總RNA用RevertAid First Strand cDNA Sythesis Kit按照試劑盒說明書逆轉錄為cDNA。取1 μL的cDNA用Lightcycler 480 SYBR Green I Master按照試劑盒說明書進行qRT-PCR，擴增程序：95 ℃ 10 min，95 ℃ 60 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，合計40個循環(huán)；GAPDH作為內參基因。GKN2正向引物：5′-GCCTGATGTACTCAGTCAACC-3′；反向引物：5′-TAGTTCTCCACCGTGTCTCC-3′。GAPDH正向引物：5′-CCAGAACATCATCCCTGCCT-3′，GAPDH反向引物：5′-CCTGCTTCACCACCTTCT TG-3′，mRNA的相對定量采用2-ΔΔCt法。

1.4.2Western blot法 將細胞冰上裂解，超聲離心后取上清，BCA法測定蛋白濃度，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉印至硝酸纖維素膜上。3%BSA封閉1 h后分別加入稀釋好的一抗4 ℃過夜，TBST洗滌3次，加入二抗封閉120 min，TBST洗滌3次后ECL發(fā)光試劑盒顯色，凝膠成像系統(tǒng)照相，分析灰度值。

1.4.3實時無標記細胞分析技術 使用RTCA S16系統(tǒng)進行檢測，在E-Plate 16的孔中加入50 μL培養(yǎng)基，檢測基線，而后加入100 μL混合均勻的細胞懸液，置于超凈臺中室溫放置30 min，最后放入培養(yǎng)箱中的RTCA S16 Station，開始進行細胞增殖的實時動態(tài)檢測。

1.4.4克隆形成實驗 將對數生長期細胞消化后，各取2 000個胃癌細胞接種到6孔板中，10～15天后，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，甲醇固定30 min，0.1%結晶紫染色10～20 min，PBS洗滌，計算克隆數。

1.4.5劃痕實驗 胰酶消化，接種到裝有劃痕愈合小室Culture-Insertu-Dish培養(yǎng)小盤，待長滿后棄原培養(yǎng)液，拔掉劃痕愈合小室，PBS浸洗，加入培養(yǎng)液，拍照；37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)48 h后，顯微鏡下觀察創(chuàng)傷愈合情況并拍照。

1.4.6Transwell法檢測細胞遷移、侵襲 在Transwell下室膜上涂抹10 μL纖連蛋白，37 ℃培養(yǎng)4 h。胰酶消化細胞，取100 μL細胞懸液(每毫升4×105個，無血清)加至Transwell小室的上室中，下室加入600 μL含30%胎牛血清的F12培養(yǎng)基，各設3個復孔。37 ℃ 5%CO2孵育24 h后取出Transwell下室，用棉簽輕輕擦去膜上面未遷移的細胞，PBS浸洗，濾膜甲醇固定30 min，晾干后，0.1%結晶紫染液染色，拍照。進行侵襲實驗時，將上室用Matrigel預涂，其他步驟同遷移測定實驗。

2 結果

2.1 胃癌、癌旁組織和細胞株中GKN2的表達Western blot法檢測結果顯示，GKN2在癌旁組織中高表達，在胃癌組織中的表達明顯下調甚至缺失。同時利用Western blot、qRT-PCR檢測胃癌細胞株AGS、SGC-7901、NCI-N87、MKN28、BGC-823、MKN45及正常胃黏膜細胞株GES-1中GKN2蛋白及mRNA表達量。本組結果顯示，GKN2呈高表達，而胃癌細胞株AGS、SGC-7901、NCI-N87、MKN28、BGC-823、MKN45中GKN2呈低表達或表達丟失，與GKN2在胃癌組織中的表達一致(圖2、3)。

2.2 GKN2過表達胃癌細胞株的構建及驗證選取AGS和SGC-7901作為實驗細胞株，分別以LV-GKN2和空載質粒LVCON238慢病毒感染細胞株構建GKN2過表達組AGS-GKN2和SGC-7901-GKN2及對照組AGS-CON和SGC-7901-CON，篩選，熒光顯微鏡下觀察3周后，肉眼觀察熒光轉染率達90%以上，利用Western blot法和qRT-PCR檢測GKN2在各細胞株中的表達，驗證了GKN2過表達組的表達量明顯增加，穩(wěn)轉細胞株建立(圖4、5)。

圖2 A.Western blot法檢測胃癌組織及正常胃黏膜組織中GKN2的表達量；B. Western blot法檢測正常胃黏膜細胞GES-1和各胃癌細胞株中GKN2的表達量：T.胃癌組織；N.正常胃黏膜組織

圖3 qRT-PCR檢測正常胃黏膜細胞和各胃癌細胞株中GKN2 mRNA的表達量

圖4 AGS穩(wěn)轉細胞株建立：A.qRT-PCR檢測穩(wěn)轉細胞株GKN2 mRNA的表達；B.Western blot法檢測穩(wěn)轉細胞株GKN2蛋白表達量，AGS-GKN2組比AGS-CON組GKN2明顯過表達；C.熒光顯微鏡下觀察AGS-CON、AGS-GKN2組熒光蛋白表達，慢病毒轉染成功率在90%以上

圖5 SGC-7901穩(wěn)轉細胞株建立：A.qRT-PCR檢測穩(wěn)轉細胞株GKN2 mRNA表達量，SGC-7901-GKN2組比SGC-7901-CON組GKN2明顯過表達；B. Western blot法檢測穩(wěn)轉細胞株GKN2 蛋白表達量，SGC-7901-GKN2組比SGC-7901-CON組的GKN2明顯過表達；C.熒光顯微鏡下觀察SGC-7901-CON、SGC-7901-GKN2組熒光蛋白表達，慢病毒轉染成功率在90%以上

2.3 GKN2過表達對胃癌細胞增殖能力的影響建立穩(wěn)轉細胞株后，采用RTCA系統(tǒng)實時檢測GKN2過表達組及對照組的細胞增殖，結果顯示，在AGS和SGC-7901細胞系中GKN2過表達顯著抑制胃癌細胞的增殖活性(P<0.05，圖6)。此外，平板克隆形成實驗表明，與對照組相比，GKN2過表達后AGS和SGC-7901細胞克隆形成數顯著降低(P<0.05，圖7)。

2.4 GKN2對胃癌細胞轉移能力的影響Transwell遷移實驗結果顯示，AGS細胞穿過聚碳酸酯多孔濾膜的AGS-CON和AGS-GKN2細胞數量分別為501.33±45.59和187.33±31.23，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。SGC-7901細胞穿過聚碳酸酯多孔濾膜的SGC-7901-CON和SGC-7901-GKN2細胞數量分別為587±28.80和85±12.20，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖8A)。

本實驗在濾膜上室側鋪上基質膠，細胞先分泌基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)將基質膠降解，才能通過濾膜進入下室。實驗進行48 h后在顯微鏡下拍照，進入下室的細胞量多則可反映腫瘤細胞的侵襲能力強。AGS細胞穿過基質膠的AGS-CON和AGS-GKN2細胞數量分別為83.67±21.89、39.00±12.20，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。SGC-7901細胞穿過基質膠的AGS-CON和AGS-GKN2細胞數量分別為560±28.18，75.33±16.75，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖8B)。

圖6 RTCA系統(tǒng)顯示GKN2過表達對胃癌細胞增殖活性的影響：A.AGS細胞株；B.SGC-7901細胞株

本組采用劃痕實驗檢測GKN2對胃癌細胞創(chuàng)傷愈合能力的影響，結果顯示，48 h后GKN2過表達組的劃痕愈合距離明顯大于對照組(P<0.05，圖8C)，提示過表達GKN2明顯抑制胃癌細胞的轉移能力。

2.5 GKN2過表達對胃癌細胞增殖及轉移相關分子水平的影響Western blot法檢測結果顯示，GKN2過表達明顯抑制胃癌細胞中增殖相關蛋白PCNA、Survivin、BCL-2的表達水平(P<0.05)。轉移相關分子研究結果顯示，GKN2過表達后，胃癌細胞中的Timp2表達水平升高，MMP-7和MMP-9表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖9)。

2.6 GKN2過表達對PI3K/AKT/PTEN/mTOR通路激活水平的影響信號通路磷酸化水平反映通路被激活情況，磷酸化水平越高通路激活越明顯。PI3K/AKT/PTEN/mTOR通路是一條公認的與腫瘤相關的通路。胃癌細胞株中GKN2過表達可下調磷酸化PI3K、磷酸化AKT、mTOR的表達水平，上調PTEN表達水平(圖10)；提示GKN2可能通過抑制PI3K/AKT/PTEN/mTOR通路的激活水平，進而發(fā)揮抑制胃癌細胞惡性生物學行為。

圖7 平板克隆實驗顯示GKN2過表達組的克隆形成數及克隆細胞群均少于對照組：A.AGS細胞株；B.SGC-7901細胞株

3 討論

GKN作為腫瘤抑制因子，在結構上具有高度保守性，在動態(tài)平衡和抑制胃腫瘤中發(fā)揮作用。GKN2作為GKN家族的重要成員，參與調控消化道上皮的增生從而維護黏膜的完整，在消化道上皮的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[5-7]。

GKN2基因位于染色體2p13，含有5個外顯子可以編碼相對分子質量為1.83×104的蛋白。GKN2是胃分泌的特異性蛋白，并帶有BRICHOS結構域，其已被證實與腫瘤相關[5-6]。據文獻報道，在

圖8 GKN2過表達對胃癌細胞轉移活性的影響：A.Transwell遷移實驗示GKN2過表達組縱向遷移細胞數明顯低于對照組；B.Transwell侵襲實驗示GKN2過表達組縱向侵襲細胞數明顯低于對照組；C.劃痕實驗示GKN2過表達組橫向遷移能力明顯低于對照組正常人胃黏膜中GKN2呈高表達，但在HP感染直到胃部腫瘤形成的過程中GKN2表達下降，根除HP后GKN2表達明顯上調。GKN2是胃黏液層的組成之一，與TFF1在胃黏膜表面形成異源二聚體復合物，保護胃黏膜和促進受損黏膜修復[5]。本實驗證實GKN2在胃癌組織和細胞株中表達明顯下調甚至缺失。上述結果表明，GKN2在維護胃黏膜的完整性和抑制腫瘤中起重要作用。

圖9 GKN2過表達下調胃癌細胞增殖及轉移相關蛋白的表達

圖10 GKN2下調PI3K/AKT/PTEN/mTOR通路的激活水平

文獻報道GKN2在胃癌細胞系中表達均下調或不表達。本實驗將GKN2高表達病毒載體轉染到人胃癌細胞株AGS、SGC-7901中，結果顯示，GKN2過表達抑制胃癌細胞的增殖和侵襲能力。目前已經證實GKN1可以抑制胃癌細胞的增值、遷移和侵襲[8]，GKN2是否也有相同的作用呢？本實驗發(fā)現GKN2過表達對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲有顯著阻滯作用，提示GKN2與GKN1一樣具有抑制胃癌細胞增值、遷移與侵襲作用。有研究表明，GKN2可能抑制超氧化物酶，導致活性氧水平升高和促進活性氧誘導的線粒體膜電位受損引起胃癌細胞凋亡，且可通過與HSP70的結合抑制NF-κB和激活JNK信號通路，從而導致胃癌細胞凋亡，抑制胃癌細胞的增殖[9]。GKN2和TFF1形成的二聚體通過增強Caspase-3/Caspase-7的活性促進細胞死亡[10]。GKN2通過下調GSK3β蛋白表達，下調Snail的表達，從而抑制胃癌細胞的上皮-間質轉化。根據以上研究結果，GKN2在胃癌增殖和侵襲轉移中發(fā)揮重要作用，是胃癌重要的抑制基因。

PI3K/AKT/PTEN/mTOR通路是一條經典的促進腫瘤進展的通路，在胃癌中常常過度激活，在胃癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[11]。PTEN是PI3K/AKT/PTEN/mTOR通路的負調控分子，可催化PI3K脫磷酸化，當其缺失時磷酸化的PI3K增加，PI3K/AKT/PTEN/mTOR通路進一步激活。mTOR是細胞生長和增殖的關鍵調節(jié)分子[12]，有研究表明，mTOR及其磷酸化形式在胃癌組織中過表達，其陽性率與淋巴結是否轉移及患者預后明顯相關，是獨立的預后因子[13]。研究發(fā)現，GKN2過表達后可以下調磷酸化PI3K、磷酸化AKT、mTOR的表達，上調抑制因子PTEN的表達，抑制通路的過度激活。因此，本實驗推測GKN2可能通過下調經典通路PI3K/AKT/PTEN/mTOR的過度激活水平，抑制胃癌細胞的增殖、侵襲、轉移等生物學功能。

綜上所述，GKN2在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，可能是具有潛力的腫瘤抑制基因，詮釋GKN2的作用機制將有助于進一步闡明胃癌的發(fā)病機制，為胃癌治療的分子靶點提供理論依據。