葛曉松，王曉莉，劉曉媛，劉 芬，高 翔，常樹建

多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)HER-2基因變異是肺癌的驅(qū)動基因之一，且部分靶向藥物治療有效[1-3]。其基因變異方式主要有兩種：HER-2編碼基因擴(kuò)增或蛋白過表達(dá)、HER-2編碼基因激活突變。其中，20外顯子插入突變是肺癌中HER-2基因最常見的突變形式[4]。有文獻(xiàn)回顧性分析了肺癌中HER-2 20外顯子插入突變的陽性率及與臨床病理特征的相關(guān)性[5-10]，而較少有文獻(xiàn)報道肺癌中HER-2 20外顯子插入與EGFR、ALK、MET、ROS1、BRAF、KRAS、NRAS、PIK3CA等9個驅(qū)動基因突變位點(diǎn)以及與PD-L1表達(dá)的相關(guān)性。本文采用熒光定量PCR法同時分析644例肺癌標(biāo)本中9個驅(qū)動基因的突變情況，探尋HER-2 20外顯子插入突變肺癌患者的臨床特征，旨在為肺癌臨床精準(zhǔn)診療提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2018年5月～2019年11月江南大學(xué)附屬醫(yī)院存檔的手術(shù)切除、氣管鏡活檢、胸水富集脫落細(xì)胞等標(biāo)本合計644例。其中男性366例，女性278例，中位年齡65歲。病理類型：鱗狀細(xì)胞癌60例，腺癌552例，無法區(qū)分鱗狀細(xì)胞癌和腺癌1例，其他類型31例(包括腺鱗癌、小細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌、肉瘤樣癌、黏液表皮樣癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌)。TNM分期：Ⅰ期267例，Ⅱ期42例，Ⅲ期88例，Ⅳ期248例，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)江南大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 肺癌標(biāo)本中DNA及RNA的提取、純化、保存及基因突變PCR檢測提取方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，在確保無交叉污染的前提下，石蠟包埋組織連續(xù)4 μm厚切片10～20張，利用石蠟組織DNA/RNA共提取試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥公司)提取基因組DNA及總RNA，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。所提取DNA于-20 ℃冰箱保存，總RNA于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。人多基因突變檢測試劑盒購于廈門艾德生物醫(yī)藥公司。PCR及RT-PCR操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，利用ABI7300型核酸擴(kuò)增儀進(jìn)行熒光定量PCR檢測。

1.3 免疫組化PD-L1單克隆抗體E1L3N購于CST公司(USA)。免疫組化染色步驟：常規(guī)脫蠟水化；檸檬酸鈉緩沖液中進(jìn)行抗原熱修復(fù)；3%雙氧水室溫孵育阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性；滴加1 ∶400稀釋的PD-L1單抗(E1L3N)，4 ℃過夜，PBS沖洗后滴加A液，室溫孵育30 min，PBS沖洗；滴加新鮮配制的DAB工作液，室溫孵育5～10 min；蘇木精復(fù)染；無水乙醇脫水封片。以PBS液替代一抗或二抗作為陰性對照。染色后的切片，根據(jù)腫瘤細(xì)胞包膜染色陰性和陽性，計算腫瘤細(xì)胞PD-L1陽性比例分?jǐn)?shù)(tumor proportion score, TPS)，計算公式為：切片中所有PD-L1陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)量/切片中所有腫瘤細(xì)胞×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計算中位年齡，分析HER-2 20外顯子插入突變與患者年齡、性別、分期以及PD-L1表達(dá)的相關(guān)性，χ2檢驗(yàn)分析差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌中驅(qū)動基因突變檢測644例肺癌檢測標(biāo)本中，454例檢測出驅(qū)動基因突變，突變陽性率為70.5%(454/644)，有469個突變位點(diǎn)(15例具有雙突變)。驅(qū)動基因突變中發(fā)生率最高的是EGFR突變，總突變率為47.2%(304/644)，包括單外顯子突變290例和雙突變14例。ALK融合突變24例，RET 12例，ROS1 6例，KRAS 56例，NRAS 1例，MET 10例，PIK3CA 4例，BRAF 6例，HER-2 20插入突變32例(單外顯子突變30例，合并RET突變1例，合并EGFR突變1例)，有190例患者未檢測出上述任何突變形式，各種驅(qū)動基因突變數(shù)量及占總突變的比例見圖1。

圖1 肺癌標(biāo)本中各驅(qū)動基因突變數(shù)量及占總突變比例分析：A.餅圖分析；B.柱狀圖分析

2.2 肺癌中HER-2 20外顯子插入突變的陽性率及臨床病理特征的相關(guān)性肺癌中HER-2 20外顯子插入突變陽性率為4.97%(32/644)，僅低于KRAS和EGFR的突變率。32例HER-2 20外顯子插入突變陽性肺癌患者中，女性21例，男性11例(表1)。62.5%(20/32)為手術(shù)切除的小結(jié)節(jié)標(biāo)本，其中高分化為17例，低分化2例，中分化1例，分化程度不詳12例。其中1例女性(例8)合并有EGFR21外顯子突變，1例男性(例32)合并有RET基因突變。

HER-2 20外顯子插入突變陽性組均為腺癌，女性比男性多見(P=0.008)，患者年齡更輕(P=0.002)，中位年齡為45歲，而HER-2 20外顯子插入突變陰性組中位年齡為65歲。同時HER-2 20外顯子插入突變患者分化程度更高(P=0.002)，分期更早(P=0.005)。χ2分析結(jié)果表明，患者年齡、性別、分化程度及分期均與HER-2 20外顯子插入突變相關(guān)，與腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)無相關(guān)性(表2)。

2.3 肺癌中HER-2與PD-L1陽性率的關(guān)系644例肺癌標(biāo)本中，PD-L1蛋白表達(dá)檢測了372例，總檢測率為57.8%，陽性定義為TPS>1%。本組結(jié)果顯示，PD-L1的總陽性率為50.3%(187/372)。其中HER-2 20外顯子插入突變陽性患者共檢測出18例PD-L1蛋白，檢測率為56.3%(18/32)，陽性率為50%(9/18)。與HER-2 20外顯子插入突變陰性患者PD-L1的陽性率(178/354，50.1%)相比，差異無顯著性。

表1 32例HER-2 20外顯子插入突變陽性肺癌患者臨床資料

2.4 肺癌中HER-2 20外顯子插入突變與HER-2過表達(dá)的關(guān)系HER-2免疫組化檢測了176例，總檢測率僅為27.3%。HER-2過表達(dá)免疫組化評分為3+。所有HER-2 20外顯子插入突變陽性病例檢測了8例HER-2的過表達(dá)情況，均未檢測到HER-2 3+。本組結(jié)果顯示：HER-2 20外顯子插入突變與HER-2過表達(dá)之間無相關(guān)性。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了HER-2 20外顯子插入突變與其他8個驅(qū)動基因的同時檢測。HER-2 20外顯子插入突變陽性率為4.97%(32/644)，這與文獻(xiàn)報道的陽性率相比略偏高[11-12]，原因可能是不同檢測方法造成的，也有可能因?yàn)楸窘M標(biāo)本中腺癌比例高達(dá)85%，這與文獻(xiàn)報道40%的比例存在一定的差異[13]，而HER-2 20外顯子插入突變多發(fā)生于腺癌[5]。

表2 肺癌驅(qū)動基因突變與臨床病理特征的相關(guān)性

本實(shí)驗(yàn)對另外8個驅(qū)動基因的突變陽性率也進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些驅(qū)動基因的陽性率與文獻(xiàn)報道基本一致[14]，同時發(fā)現(xiàn)KRAS突變患者和HER-2 20外顯子插入突變陽性患者的多個臨床病理特征截然相反。表現(xiàn)為KRAS突變多發(fā)生于男性(P<0.001)，低分化(P=0.029)，且分期較晚(P<0.001)的患者。此外，實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)2例HER-2 20外顯子插入突變分別與EGFR21和RET存在雙突變。有文獻(xiàn)報道具有雙驅(qū)動基因突變患者靶向治療效果較差，預(yù)后欠佳。

肺癌中HER-2 20外顯子插入突變的形式約30種，最常見的3個HER-2 20外顯子插入突變片段分別為A775_G776ins(YVMA)、G776delinsVC(VC)和P780_Y781insGSP(GSP)，占所有HER-2 20外顯子插入突變的94%[3]。本實(shí)驗(yàn)主要檢測的也是該三種突變，但PCR法采用的是混合引物，無法進(jìn)一步區(qū)分具體的突變形式，這也是目前絕大多數(shù)醫(yī)院進(jìn)行的驅(qū)動基因檢測的缺點(diǎn)之一。有文獻(xiàn)報道，HER-2 20外顯子插入突變形式不同，對抗HER-2藥物的反應(yīng)差異較大[3]。因此，有必要進(jìn)一步細(xì)分HER-2 20外顯子插入突變的亞型，為更精準(zhǔn)肺癌診療提供數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，利用熒光定量PCR法對肺癌標(biāo)本中HER-2 20外顯子插入突變進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)肺癌中HER-2 20外顯子插入突變陽性率接近5%，因此該類型突變在肺癌中并非罕見，且均為腺癌，女性比男性更常見，同時HER-2 20外顯子插入突變可與EGFR、RET等突變共存。本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果可能對未來臨床指導(dǎo)肺癌精準(zhǔn)靶向治療有積極作用。