陳 志，王玉紅，朱衛(wèi)東，孫曉靜，郭凌川

肺癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，提高肺癌患者的生存率，早期篩查和診斷至關(guān)重要。有文獻(xiàn)報(bào)道血液中腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigen, TAA)自身抗體檢測(cè)對(duì)早期肺癌有良好的診斷效能[1]。國(guó)內(nèi)外有研究證實(shí)多種TAA與肺癌相關(guān)，且腫瘤患者血清TAA水平與健康人群存在明顯差異，可用于肺癌患者的早期篩查和臨床診斷[2-4]。本文采用7種TAA自身抗體(p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGEA1、CAGE)，檢測(cè)血液中7種自身抗體的含量，探討其對(duì)非小細(xì)胞肺癌診斷的價(jià)值和意義，旨在提高臨床與病理醫(yī)師的認(rèn)識(shí)水平。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年8～12月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科行肺癌自身抗體檢測(cè)，并有活檢或手術(shù)病理診斷為非小細(xì)胞肺癌的標(biāo)本443例。其中男性170例，女性273例；腺癌410例，鱗癌18例，其他類型15例。另隨機(jī)選擇同期體檢健康的人群405例作為對(duì)照組。

1.2 主要儀器與試劑Multiskan MK3型酶標(biāo)儀(Thermo公司)，ELISA檢測(cè)試劑盒(上海優(yōu)選生物公司)，離心機(jī)，加樣器，恒溫箱等。

1.3 方法采集所有患者靜脈血5 mL(促凝管)，登記編號(hào)，離心機(jī)3 000 r/min離心10 min，取上清。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)。采用ELISA法檢測(cè)7種自身抗體濃度，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。因血清抗體水平呈偏態(tài)分布，故用中位數(shù)M(p25，p75)法表示，兩組間比較采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。通過(guò)繪制ROC曲線分析抗體單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能?？贵w陽(yáng)性率對(duì)比及臨床病理特征分析采用χ2檢驗(yàn)，比較組間差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 7種自身抗體的檢測(cè)水平非小細(xì)胞肺癌組與對(duì)照組均采用中位數(shù)法M(p25，p75)表示每個(gè)抗體的分布情況。兩組間相比，除PGP9.5抗體(P=0.154)無(wú)差異外，非小細(xì)胞肺癌組p53(P<0.001)、SOX2(P=0.049)、GAGE7(P=0.040)、GBU4-5(P=0.005)、MAGEA1(P=0.025)、CAGE(P=0.036)血清含量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1，圖1)。

2.2 7種自身抗體的陽(yáng)性率非小細(xì)胞肺癌組7種自身抗體的檢測(cè)陽(yáng)性率為0.9%～22.35%，對(duì)照組陽(yáng)性率為0～4.20%。每種抗體的cut off值參照檢測(cè)試劑盒的診斷標(biāo)準(zhǔn)：p53<13.1 U/mL、PGP9.5<11.1 U/mL、SOX2<10.3 U/mL、GAGE7<14.4 U/mL、GBU4-5<7.0 U/mL、MAGEA1<11.9 U/mL、CAGE<7.2 U/mL，大于或等于參考值即為陽(yáng)性。本組結(jié)果顯示非小細(xì)胞肺癌組p53陽(yáng)性率最高(22.35%)，PGP9.5陽(yáng)性率最低(0.90%)，其余陽(yáng)性率為2.48%～13.54%。與對(duì)照組相比，非小細(xì)胞肺癌組p53、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGEA1、CAGE均有較高的陽(yáng)性率(P<0.001)，PGP9.5無(wú)差異(P>0.05)。將7種自身抗體聯(lián)合檢測(cè)(任一種抗體陽(yáng)性即視為陽(yáng)性)分析，非小細(xì)胞肺癌組的陽(yáng)性率為56.66%，對(duì)照組的陽(yáng)性率為6.42%，兩者相比差異有顯著性(P<0.001，圖2)。

2.3 7種自身抗體的診斷效能評(píng)價(jià)本組以患者的病理診斷結(jié)果為判斷金標(biāo)準(zhǔn)，將病理診斷為非小細(xì)胞肺癌的患者作為疾病發(fā)生組，將健康人群作為對(duì)照組，繪制每個(gè)抗體的ROC曲線及聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線，分析7種自身抗體的診斷效能。進(jìn)一步分析各個(gè)抗體及聯(lián)合檢測(cè)的曲線下面積(AUC)，每種抗體作為單一因素時(shí)，PGP9.5無(wú)診斷效能(P>0.05)，其他指標(biāo)雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但敏感性、特異性參差不齊，診斷效能不高。聯(lián)合檢測(cè)敏感性達(dá)56.66%、特異性為93.58%，AUC為0.751，具有較高的診斷效能(P<0.001，表2，圖3)。

2.4 聯(lián)合檢測(cè)7種自身抗體與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系本組分析非小細(xì)胞肺癌組7種自身抗體聯(lián)合檢測(cè)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示：患者性別(P>0.05)、年齡(P>0.05)、腫瘤大小(P>0.05)、病理分型(P>0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P>0.05)、TNM分期(P>0.05)以及ALK(P>0.05)與7種自身抗體聯(lián)合檢測(cè)無(wú)關(guān)；而PD-L1(P<0.05)表達(dá)與7種自身抗體聯(lián)合檢測(cè)有關(guān)(表3)。

圖1 7種自身抗體的檢測(cè)濃度分布：A.p53；B.PGP9.5；C.SOX2；D.GAGE7；E.GBU4-5；F.MAGEA1；G.CAGE

表3 聯(lián)合檢測(cè)7種自身抗體與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系

圖2 7種自身抗體的陽(yáng)性率

3 討論

肺癌的發(fā)生、發(fā)展是在多種致癌因素和多基因影響下經(jīng)過(guò)多個(gè)步驟形成的。目前，臨床廣泛采用的診斷手段多為X線、CT、MRI等影像檢查或纖維支氣管鏡及肺穿刺等病理診斷方法。近年血清生物學(xué)標(biāo)志物的檢測(cè)越來(lái)越受到關(guān)注，其價(jià)格低廉、樣本獲取容易，且檢測(cè)結(jié)果具有鑒別診斷價(jià)值[5-6]。TAA自身抗體是惡性腫瘤細(xì)胞在發(fā)展過(guò)程中激活細(xì)胞和免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗腫瘤細(xì)胞抗原的自身抗體，釋放入血，在血清中穩(wěn)定存在。本組7種自身抗體有大量基礎(chǔ)研究報(bào)道，并已應(yīng)用于臨床，其檢測(cè)準(zhǔn)確、迅速，結(jié)果可靠。

本實(shí)驗(yàn)回顧性分析848例標(biāo)本，非小細(xì)胞肺癌組7種自身抗體中有6項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)水平高于對(duì)照組，僅PGP9.5除外。本組結(jié)果提示7種自身抗體聯(lián)合檢測(cè)能有效鑒別非小細(xì)胞肺癌患者與健康人群，與國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道基本一致[7-8]。

文獻(xiàn)報(bào)道[9-10]7種自身抗體中p53在腫瘤組中的陽(yáng)性率最高，其屬于抑癌基因，在多種腫瘤中存在異常表達(dá)和突變。有研究發(fā)現(xiàn)，p53在肺癌患者中有突變和表達(dá)異常[11]，蔡學(xué)琴等[12]報(bào)道肺癌患者血清及胸水中p53抗體水平高于對(duì)照組，這可能是導(dǎo)致肺癌患者p53升高的原因之一。PGP9.5抗體在肺癌組和對(duì)照組的陽(yáng)性率均較低，說(shuō)明該抗體在人群中呈低表達(dá)，故無(wú)法區(qū)分腫瘤患者與非腫瘤患者。應(yīng)用聯(lián)合檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌組的陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組，進(jìn)一步提示聯(lián)合檢測(cè)能有效鑒別腫瘤人群與健康人群。

一種腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物或一種實(shí)驗(yàn)方法能否有效用于腫瘤的篩查、診斷與鑒別診斷，其診斷效能的評(píng)價(jià)必不可少[13]。應(yīng)用ROC曲線分析自身抗體的敏感性、特異性，評(píng)價(jià)其診斷效能是臨床上常用的方法。本組ROC曲線繪制結(jié)果表明，單個(gè)應(yīng)用每種自身抗體，其敏感性、特異性參差不齊，應(yīng)用價(jià)值不高。本組聯(lián)合檢測(cè)可明顯提升其AUC至0.751，且聯(lián)合檢測(cè)敏感性56.66%、特異性93.58%，提示聯(lián)合檢測(cè)具有更高的診斷效能。

本組進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測(cè)7種自身抗體在非小細(xì)胞肺癌中的陽(yáng)性率與患者年齡、性別、腫瘤大小、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征均無(wú)關(guān)；與PD-L1的表達(dá)有顯著相關(guān)性。ALK和PD-L1是肺癌免疫組化檢測(cè)的常用指標(biāo)，若發(fā)生ALK基因重排(EML4-ALK)，可促使肺癌發(fā)生和進(jìn)展[14-15]，文獻(xiàn)報(bào)道ALK陽(yáng)性占非小細(xì)胞肺癌的5%～7%[16]，本組為1.93%(8/414)?？诉蛱婺?Crizotinib)是治療ALK陽(yáng)性非小細(xì)胞肺癌有效的靶向藥物，本組未發(fā)現(xiàn)7種自身抗體聯(lián)合檢測(cè)的陽(yáng)性率與ALK陽(yáng)性率有相關(guān)性。PD-L1是近年分子靶向治療的新熱點(diǎn)[17]，有研究顯示PD-1/PD-L1在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后有相關(guān)性[18]。本組發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)7種自身抗體的陽(yáng)性率與PD-L1的表達(dá)差異有顯著性，PD-L1陽(yáng)性者的自身抗體陽(yáng)性率更高。臨床實(shí)驗(yàn)表明PD-1/PD-L1的表達(dá)可為臨床用藥提供參考[19]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示肺癌自身抗體的表達(dá)水平與PD-L1有相關(guān)性，但能否為PD-1/PD-L1抑制劑的用藥作為參考，還需要進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，聯(lián)合檢測(cè)7種自身抗體有助于臨床醫(yī)師對(duì)肺癌高危人群的診斷和鑒別診斷。但該方法仍為重要輔助手段之一，臨床、病理醫(yī)師還需結(jié)合患者的臨床特點(diǎn)、影像學(xué)特征、病理活檢等多種手段綜合判斷。