須懷沙，王易欣，陳旭鋒，蔣 雷，王 軍，張久平

1南京鼓樓醫(yī)院醫(yī)學(xué)心理科，江蘇 南京 210008；2南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理系，江蘇 南京 211166；3南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科，江蘇 南京 210029；4南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院兒童心理衛(wèi)生研究中心，江蘇 南京 210029

甲基苯丙胺（methamphetamine，Meth），俗稱冰毒，其濫用已成為世界性公共衛(wèi)生問題，Meth 濫用表現(xiàn)為肝臟、腎臟、免疫、精神、神經(jīng)多組織多系統(tǒng)損傷，甚至導(dǎo)致死亡［1］。研究顯示，神經(jīng)系統(tǒng)是Meth作用的主要靶器官，因其損傷導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力下降、海馬區(qū)體積縮小、多巴胺能神經(jīng)元特異性凋亡等神經(jīng)退行性病變雖近年來引起人們的廣泛關(guān)注［2］，但其毒性作用及機(jī)制仍有待明確。神經(jīng)炎性反應(yīng)被認(rèn)為是Meth 濫用引起神經(jīng)元損傷的主要機(jī)制之一，涉及腦中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活伴隨大量炎性因子的釋放。利用體外實(shí)驗(yàn)，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Meth 暴露可引起Toll 樣受體（Toll like receptors，TLR）-4的高表達(dá)，伴隨下游炎性通路絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）及核因子（nuclear factor，NF）-κB的激活［3］，然而Toll樣受體家族包含多個(gè)亞型受體，Meth暴露是否可引起其他亞型TLR 表達(dá)改變，TLR 與下游信號通路如何進(jìn)行信號傳遞？這些問題仍不清楚。因此，本研究通過Meth暴露后對TLR的表達(dá)，下游接頭蛋白髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、β干擾素TIR 結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β，TRIF）及泛素化蛋白E3泛素連接酶Pellino 1（Peli1）的探討，旨在闡述TLR-Peli1軸在Meth 引起小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)中的作用，從而為Meth神經(jīng)毒性的干預(yù)提供潛在靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

BV2 細(xì)胞系來自ATCC（美國），Meth（北京中國食品藥品檢定研究所，標(biāo)準(zhǔn)品號：171212，純度99.9%），DMEM（Hyclone 公司，美國），胎牛血清（Gibco 公司，美國），BCA 蛋白定量試劑盒（Thermo Scientific 公司，美國），Anti-TLR3、Anti-TLR4、Anti-TLR8、Anti-TLR11、Anti-TRIF、Anti-MyD88（Abcam公司，美國），Anti-TLR7（Santa Cruz公司，美國），Anti-NF-κB p65、Anti-Phospho NF-κB p65（Cell Signaling Technology 公司，美國），Anti-Peli1（Santa Cruz，美國），Anti-β-actin（Sigma Aldich 公司，美國），HRP 標(biāo)記的二抗：HRP Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）、HRP Goat Anti-Mouse IgG（H+L）、HRP Goat Anti-Rat IgG（H+L）（Jacksonimmuno公司，美國），PVDF膜及ECL發(fā)光液（Millipore 公司，美國），Lipofectamin 2000 轉(zhuǎn)染試劑（Thermo Fisher Scientific 公司，美國），Peli1 siRNA、TLR siRNA 及對照組siRNA（上海吉瑪公司），TNF-α及IL-6 ELISA試劑盒（R&D公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將BV2（小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞）培養(yǎng)于DMEM（含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素）培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）培養(yǎng)2～4 d，隔天更換培養(yǎng)液。該細(xì)胞經(jīng)Meth處理后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 蛋白免疫印跡分析

將細(xì)胞PBS清洗后，用含Cocktail的蛋白裂解液（RIPA，1∶500）裂解，離心后取上清，利用BCA 蛋白試劑盒進(jìn)行定量。每孔泳道加入30 μg蛋白進(jìn)行電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，利用5%脫脂奶粉溶液進(jìn)行封閉，并與一抗進(jìn)行預(yù)孵過夜。次日，與二抗孵育1 h，將ECL發(fā)光液A液、B液（1∶1）均勻覆于膜上，置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像。Western blot條帶經(jīng)Image J軟件進(jìn)行灰度掃描分析。

1.2.3 ELISA檢測炎性因子

在孔板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔8 孔，在第1 孔加標(biāo)準(zhǔn)品200 μL，然后從第1 孔取100 μL 加到第2 孔（第2～8孔都含有標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液），混勻后，再從第2 孔取出100 μL加入第3孔，依次進(jìn)行梯度稀釋，最后一孔僅為稀釋液不再添加標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋后各孔加樣量都為100 μL，濃度分別為1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5、31.3、15.7、0 ng/mL。Meth與BV2細(xì)胞孵育24 h后，取其上清10 μL，加入到預(yù)先加有90 μL 稀釋液的孔中（即每孔100 μL），孵育2 h，洗滌，每孔加入酶標(biāo)抗體工作液1 h，洗滌后，加入底物工作液100 μL，反應(yīng)20 min后加入50 μL終止液，混勻，在492 nm波長下測定其吸光度值。該實(shí)驗(yàn)分別重復(fù)3 次（即細(xì)胞與Meth 染毒3 次），每次每個(gè)樣本設(shè)3 個(gè)平行復(fù)孔，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）形式表示。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR

提取BV2 細(xì)胞mRNA 后，通過PrimeScriptTMRT reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑（TaKaRa 公司，日本），取0.5 μg mRNA 將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按PrimeScriptTMreagent Kit 試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，重復(fù)3 次，每次平行復(fù)孔5個(gè)，β-actin作為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt法對結(jié)果進(jìn)行定量。

1.2.5 BV2細(xì)胞siRNA干擾

為研究Peli1、TLR4 在Meth 引起炎性因子釋放中的作用，將BV2 細(xì)胞分為對照組（不做任何處理）、NC組（加入對照siRNA）、Meth組（加入Meth處理），NC+Meth 組（加入對照siRNA 和Meth 處理），SiPeli1 組（加入Peli1 siRNA 處理），SiTLR4+Meth 組（加入TLR4 siRNA 和Meth 處理），SiPeli1+Meth 組（加入Peli1 siRNA 和Meth 處理）。siRNA 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)，將5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板（不含抗生素）中，利用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用200 μL Opti-MEM I Reduced Serum Medium（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）稀釋，加入Peli1 siRNA，室溫靜置20 min，形成siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混和物，將siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混和液加入含有細(xì)胞及培養(yǎng)液的孔中，均勻混和。在37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h 后可將培養(yǎng)基換為含血清的完全培養(yǎng)基；24 h后在蛋白水平觀察Peli1干擾后的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組定量資料比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)兩兩比較用Dunnett-t檢驗(yàn)，兩組定量數(shù)據(jù)比較用Student’sttest，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，繪圖使用GraphPad Prism 7.0。

2 結(jié)果

2.1 Meth對小膠質(zhì)細(xì)胞IL-6、TNF-α表達(dá)的影響

基于我們前期工作中Meth 的使用濃度結(jié)合Meth濫用后在人體液中濃度的報(bào)道［4-5］，300 μmol/L Meth用來處理小膠質(zhì)細(xì)胞24 h。Meth作用后，利用ELISA檢測細(xì)胞上清液炎性因子的濃度，結(jié)果顯示，Meth 處理的BV2 細(xì)胞分泌的IL-6、TNF-α的含量與對照組比較顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖1A、1B）。

2.2 Meth對多種亞型TLR蛋白的作用

TLR在引發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞IL-6及TNF-α表達(dá)及分泌過程中發(fā)揮重要作用。因此，我們在蛋白水平觀察了Meth 對小膠質(zhì)細(xì)胞TLR 家族中4、7、8 亞型受體蛋白的表達(dá)（圖2A～D）。將BV2 細(xì)胞分別與0、100、300、900 μmol/L Meth 孵育24 h，發(fā)現(xiàn)TLR7、TLR8蛋白表達(dá)量隨Meth濃度的增加而升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。接著，利用300 μmol/L Meth與BV2細(xì)胞分別孵育0、6、12、24、48 h（圖2E～G），發(fā)現(xiàn)TLR7、TLR8在Meth作用24 h時(shí)表達(dá)最高。

上述受體皆可通過MyD88這一接頭蛋白傳遞炎性信號，而TLR3是唯一通過TRIF這一接頭蛋白傳遞下游信號的［6］，因此，本研究亦觀察了Meth對TLR3表達(dá)的改變，不同濃度Meth（0、100、300、900 μmol/L）與BV2細(xì)胞孵育24 h后，TLR3表達(dá)呈濃度依賴性增高（圖3A、B），而將Meth與BV2細(xì)胞孵育不同時(shí)間（0、6、12、24、48 h）后，發(fā)現(xiàn)TLR3 在12 h 及24 h 時(shí)間點(diǎn)上調(diào)，后逐漸恢復(fù)（圖3C、D）；此外，本研究亦觀察了TLR11 在Meth 作用后的改變。Meth 作用BV2 細(xì)胞后，TLR11 的表達(dá)顯著上升（圖3E、F），與BV2 細(xì)胞分別孵育不同時(shí)間點(diǎn)后（圖3G、H），與對照組相比，各時(shí)間點(diǎn)的TLR11表達(dá)顯著增高（P＜0.05）。

2.3 Meth對接頭蛋白MyD88及TRIF通路表達(dá)的影響

接著對TLR 介導(dǎo)的下游MyD88 依賴型和MyD88 非依賴型TRIF 信號通路進(jìn)行了探討。不同濃度Meth 處理BV2 細(xì)胞24 h 后，TRIF 蛋白表達(dá)增高，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4A、C）；此外，300 μmol/L Meth與BV2細(xì)胞孵育不同時(shí)間，TRIF 在各時(shí)間點(diǎn)均表達(dá)增高，其中24 h 時(shí)間點(diǎn)TRIF 的表達(dá)達(dá)到峰值（圖4B、D）。此外，MyD88在Meth 暴露后，亦有明顯增加的趨勢，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖A、B、E、F，P＜0.05）。

2.4 Meth對小膠質(zhì)細(xì)胞Peli1蛋白表達(dá)的影響

圖2 Meth對小膠質(zhì)細(xì)胞TLR家族蛋白表達(dá)水平的影響Figure 2 Effects of Meth on the expression of Toll like receptor family proteins in BV2 cells

圖3 Meth對小膠質(zhì)細(xì)胞TLR3和TLR11蛋白的調(diào)節(jié)作用Figure 3 Effects of Meth on expression of TLR3 and TLR11 proteins

Peli1蛋白在TLR4介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中起“橋梁”作用，因而本研究探討了Meth 對小膠質(zhì)細(xì)胞中Peli1 蛋白表達(dá)的影響。300 μmol/L Meth處理BV2細(xì)胞0、15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h，Peli1 蛋白表達(dá)隨時(shí)間逐漸升高，3 h 達(dá)到峰值后有下降趨勢，但均高于未處理組（P＜0.05，圖5）。

2.5 Peli1 對Meth 引起小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子表達(dá)、釋放及NF-κB通路的影響

TLR4是唯一可以同時(shí)介導(dǎo)MyD88及TRIF通路的TLR［7］，因此，本研究觀察了TLR4及Peli1在Meth引起炎性反應(yīng)中的作用。Peli1經(jīng)siRNA干擾后，蛋白表達(dá)量明顯降低（圖6A）；Meth暴露促進(jìn)TNF-α及IL-6的表達(dá)，而Peli1 干擾后，TNF-α及IL-6 分泌降低（圖6B～D）。此外，在mRNA水平，Peli1的敲減同樣緩解了Meth 引起炎性因子iNOS 及TNF-α mRNA 表達(dá)的增多（圖6E、F）。

基于上述Peli1下調(diào)可明顯逆轉(zhuǎn)Meth 促進(jìn)炎性遞質(zhì)產(chǎn)生的現(xiàn)象，觀察了炎性調(diào)節(jié)的關(guān)鍵通路NFκB 的激活情況。Peli1 干擾24 h 后，Meth 作用BV2細(xì)胞30 min，NF-κB被顯著激活，而將Peli1下調(diào)后，Meth引起NF-κB的激活情況被明顯逆轉(zhuǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7）。

圖4 Meth對TRIF和MyD88蛋白水平的影響Figure 4 Effects of Meth on TRIF和MyD88 protein expression

圖5 Meth對BV2細(xì)胞Peli1蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effects of Meth on Peli1 protein expression in BV2 cells

3 討論

目前，以苯丙胺類、氯胺酮為代表的新型合成類毒品濫用增長迅速，且向低齡化趨勢發(fā)展?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，在多種苯丙胺毒品中，Meth 造成的全球健康威脅最大。該威脅不僅在于其全球的快速蔓延，更重要的是，Meth濫用引起機(jī)體極大的損傷，尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，研究顯示，Meth濫用可引起神經(jīng)退行性病理性蛋白的聚集，繼而損傷神經(jīng)細(xì)胞［8］。因此，Meth的濫用已成為全球范圍內(nèi)日益嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題。

Meth損傷神經(jīng)元的機(jī)制比較復(fù)雜，主要涉及氧化應(yīng)激損傷、興奮性毒性、惡性高熱及炎癥反應(yīng)等［9］，而這些機(jī)制的探討多建立在Meth 對神經(jīng)元的直接損傷上，對數(shù)量10倍于神經(jīng)元的膠質(zhì)細(xì)胞的作用研究較少。越來越多的證據(jù)顯示，神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞所處的微環(huán)境改變對神經(jīng)元生理、病理的變化發(fā)揮重要作用，尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎性微環(huán)境。

圖6 Peli1干擾后Meth誘導(dǎo)BV2細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的變化Figure 6 Effects of Meth on inflammatory factors after silence of Peli1 in BV2 cell

圖7 Peli1對NF-κB通路的影響Figure 7 Role of Peli1in NF-κB signaling pathway after Meth treatment

TLR 是Ⅰ型跨膜蛋白，其胞外結(jié)構(gòu)參與多種病原體的識別，胞內(nèi)含有Toll/IL-1受體同源區(qū)，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)多種Toll 樣受體蛋白［10］，在調(diào)節(jié)神經(jīng)炎性微環(huán)境、引起神經(jīng)元損傷的過程中發(fā)揮重要作用。TLR介導(dǎo)的信號傳遞主要分為MyD88依賴性和MyD88非依賴性兩種，前者通過激活腫瘤壞死因子受體活化因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）支配MAPK 和NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，產(chǎn)生炎性因子［11］。而后者通過接頭蛋白TRIF激活下游信號IRF3的轉(zhuǎn)錄及NF-κB磷酸化，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)［12］。目前關(guān)于Meth對TLR的調(diào)節(jié)多集中于TLR4，研究顯示，Meth 可通過結(jié)合并穩(wěn)定MD-2 受體與TLR4 的結(jié)合，引起小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及IL-6 大量分泌，引起中樞伏隔核多巴胺釋放增多，導(dǎo)致神經(jīng)毒性［3］。既往研究顯示，Meth可通過上調(diào)TLR4 的表達(dá)，引起下游炎性通路激活及炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的釋放［13］。此外，最近研究顯示，Meth 同樣可通過其他TLR 介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。Burns 等［14］將Meth 與巨噬細(xì)胞孵育，發(fā)現(xiàn)炎性因子TNF-α、IL-8、CXCL1、CXCL16 顯著升高，而這一過程依賴于TLR9。本研究首次發(fā)現(xiàn)，Meth 作用后，除了TLR4 及TLR9，TLR3、TLR7、TLR8 及TLR11 蛋白水平表達(dá)亦顯著增高，提示這4 種TLR 的亞型可能在Meth 引起小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)或其他功能中發(fā)揮潛在作用，但其作用及機(jī)制仍需進(jìn)一步深入挖掘。因TLR3通過TRIF途經(jīng)調(diào)節(jié)下游信號，TLR4可同時(shí)調(diào)節(jié)MyD88 及TRIF 介導(dǎo)的下游信號，而其他TLR 僅通過MyD88 完成下游信號的傳遞，因此，對TLR 下游信號進(jìn)行進(jìn)一步探索，發(fā)現(xiàn)Meth 作用后，接頭蛋白MyD88表達(dá)上調(diào)，同時(shí)另一接頭蛋白TRIF表達(dá)亦明顯增加，進(jìn)一步證明了上述多種TLR參與Meth引起炎性反應(yīng)的可能性。此外，本研究還證明了Peli1 在Meth 引起下游炎性信號傳遞中的作用。Peli 家族有Peli1、Peli2、Peli3，近年來，Peli1 介導(dǎo)的炎性作用在多種炎性模型中被揭示。有學(xué)者利用脂多糖建立小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)Peli 家族中僅有Peli1 上調(diào)，提示Peli1 在小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)中的特異性。Chang等［15］通過建立小鼠膿毒血癥休克模型，發(fā)現(xiàn)高劑量脂多糖在9 h 內(nèi)引起大多數(shù)小鼠死亡，而Peli1敲除的膿毒性休克小鼠24 h后亦未發(fā)生死亡現(xiàn)象。本研究將Peli1敲減后，Meth引起的TNF-α、IL-6等炎性因子分泌及表達(dá)顯著降低，而調(diào)節(jié)炎性信號的NF-κB活性被顯著抑制，說明Peli1在Meth引起的小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，Meth 暴露可引起多種TLR 的表達(dá)，引起大量炎性因子的表達(dá)及分泌，在該過程中，MyD88、TRIF及其下游泛素化蛋白Peli1發(fā)揮重要作用（圖8）。因此，針對TLR-MyD88/TRIF-Peli1 將有利于Meth神經(jīng)毒性的干預(yù)。

圖8 TLR-Peli1 在Meth 引起小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)中作用的示意圖Figure 8 Schematic representation of the effects of TLRPeli1 on Meth induced BV2 microglial inflammation