吉薇，吉宏武

1(廣東第二師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，廣東 廣州, 510303)2(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東 湛江, 524088)

尿酸由嘌呤代謝而生成，在人體肝臟部位形成，在腎臟的作用下以尿液形式排出體外，如無特殊影響，人體的血尿酸不會出現(xiàn)大幅波動，而是以一種動態(tài)平衡狀態(tài)存在，成年男性含量為149～416 μmol/L、成年女性含量為89～357 μmol/L。人體血尿酸2/3是內(nèi)源產(chǎn)生的，1/3的尿酸來自于肉類、海鮮等食品，長期攝入過量的高嘌呤食物或身體疾病等原因會造成嘌呤代謝紊亂，從而導(dǎo)致尿酸含量過高[1]。新時(shí)期下，人們生活水平提升的同時(shí)，對飲食也提出了較高的要求，而高尿酸血癥患者數(shù)量也呈現(xiàn)出逐年遞增的趨勢。醫(yī)學(xué)上來講，血尿酸的增高會引發(fā)諸如痛風(fēng)、高血壓、糖尿病等一系列并發(fā)癥[2-3]。現(xiàn)階段，臨床上用以抗高尿酸血癥的藥物包括：黃嘌呤氧化酶抑制劑、尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1抑制劑、尿酸氧化酶類似物，這些藥物雖具有較好的療效，但毒副作用大，常出現(xiàn)腹痛、惡心、嘔吐、發(fā)熱等癥狀[4]。因此，尋找安全、高效的天然降尿酸食源性成分已成為眾多研究者的研究方向。

生物活性肽不僅在人體內(nèi)易于吸收、安全可靠，且制造成本較為低廉，其生物活性豐富多樣，具有極大的利用價(jià)值。以海洋魚類為原料制備具有多功能的活性肽受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注[5]。MUROTA等[6]發(fā)現(xiàn)，自鯊魚軟骨水解物提取的2種活性肽，有較好的治療痛風(fēng)的藥效，分別為Tyr-Leu-Asp-Asn-Tyr和 Ser-Pro-Pro-Tyr-Trp-Pro-Tyr，最終認(rèn)定，該分離物中黃嘌呤氧化酶抑制活性極高，高出別嘌呤醇的13～23倍。趙謀明等[7]報(bào)道，采用中性蛋白酶和胰酶共同水解秋刀魚，在水解物中得到含有黃嘌呤氧化酶抑制肽。柯虹喬等[8-11]報(bào)道，金槍魚低聚肽生物活性豐富，不僅有利于抗氧化、降血壓、抗疲勞，同時(shí)也具有調(diào)節(jié)代謝疾病的功效。HE等[12]從金槍魚酶解產(chǎn)物中分離出的Phe-His二肽具有很強(qiáng)的黃嘌呤氧化酶抑制活性(IC50=25.7 mmol/L)，有顯著降尿酸作用。

鰹魚別名炸彈魚，具體分類有圓舵鰹、扁舵鰹、狐鰹等亞種，學(xué)界一般將其歸為低值金槍魚[13]，是我國金槍魚捕撈量最大的品種，在我國東海、南海分布廣泛[14]。鰹魚的蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量低、具有營養(yǎng)價(jià)值高的特點(diǎn)，但是，鰹魚的產(chǎn)品較為單一，主要加工為罐頭食品，產(chǎn)品附加值低[15]。鰹魚具有豐富的肌肽和鵝肌肽，李宇娟[16]報(bào)道鰹魚背部肉中鵝肌肽含量高達(dá)1.26 mg/g，具有顯著降低血清尿酸水平的功效。鰹魚通過酶法水解也可以制備出具有降尿酸功效的活性肽，李宇娟[16]從鰹魚酶解產(chǎn)物中分離純化出4條具有抑制黃嘌呤氧化酶(xan-thine oxidase，XOD)活性的多肽：Pro-Gly-Ala-Cys-Ser-Asn，Trp-Met-Leu，Ala-Met-Pro-Phe和Phe-Gly-Val-Gly；鄒琳等[17]從鰹魚魚肉中分離純化出Ala-Cys-Glu-Cys-Asp，其XOD抑制活性IC50值為7.23 mg/mL，具有較好的降尿酸效果。

本研究目的是采用高尿酸大鼠動物模型對扁舵鰹魚酶法水解制備的低聚肽降尿酸功效進(jìn)行評價(jià)，促進(jìn)對降尿酸食品開發(fā)與生產(chǎn)制備工程的探究，為高尿酸血癥治療和調(diào)養(yǎng)的長期研究提供一些理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

扁舵鰹魚(Auxisthazard)，體長50～60 cm，購于廣東省茂名市博賀港，置于-20 ℃超低溫冰箱備用。

實(shí)驗(yàn)大鼠，選取SPF級SD雄性大鼠共計(jì)60只，單只重量在140～160 g，置于21～25 ℃的飼養(yǎng)環(huán)境下，相對濕度控制在55%～65%。直接由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心展開該扁坨鰹魚降尿酸作用研究試驗(yàn)(批準(zhǔn)文號：GDMLAC/F-IAC01)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

動物蛋白水解酶(200萬U/g)，廣西南寧龐博生物工程有限公司；別嘌醇片，世貿(mào)天階制藥(江蘇)有限責(zé)任公司；腺嘌呤，Sigma公司；羧甲基纖維素鈉，天津市福晨化學(xué)試劑廠；甲醛，西隴科學(xué)股份有限公司；磷酸緩沖鹽粉末，鼎國昌盛。尿酸、尿素氮、肌酐、黃嘌呤氧化酶試劑盒，上?？迫A生物工程股份有限公司。

1.3 主要儀器

YP1002 N電子分析天平，德國Sartorius；TM-CM-01陶瓷膜分離設(shè)備、WTM-1812G膜分離設(shè)備，杭州沃騰膜工程有限公司；日立7020全自動生化分析儀，日本株式會社日立高新技術(shù)；KDC-2046低速冷凍離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；5418臺式高速離心機(jī)，德國Eppendorf。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 扁舵鰹魚低聚肽(Auxisthazardoligopeptide,ATO)的制備

扁舵鰹魚去頭、去骨與內(nèi)臟，清洗、勻漿，然后在50 ℃條件下，添加0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的動物蛋白水解酶和0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的風(fēng)味酶，調(diào)節(jié)pH至7.5，酶解3 h，在90～100 ℃條件下加熱10 min滅酶，在4 000 r/min 條件下離心15 min，啟動管式離心機(jī)將上清液進(jìn)行(15 000 r/min)脫油，在產(chǎn)物酶解液之中摻入適量的珍珠巖完成脫色脫苦操作，珍珠巖添加量為3 g/100L，靜置0.5～1.0 h，澄清液通過陶瓷膜(孔徑 200 nm)過濾，然后使用截留分子質(zhì)量為5 000 u的超濾膜進(jìn)行分離，過濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥進(jìn)口溫度為175 ℃，出口溫度為210 ℃，獲取產(chǎn)物—低聚肽粉，將其放置于溫度為4 ℃的干燥器內(nèi)儲存，以便后期使用[18]。

1.4.2 建立高尿酸大鼠模型

實(shí)驗(yàn)動物根據(jù)血尿酸值隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組和ATO低、中、高劑量組。除正常對照組外，各組動物均給予腺嘌呤溶液，每日劑量為250 mg/kg體重，正常對照組給予純水，連續(xù)30 d建立高尿酸血癥大鼠模型。

1.4.3 降尿酸動物試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)動物基于腺嘌呤3 h后，ATO低、中和高劑量組分別給予0.8、1.6和2.4 g/kg體重劑量的ATO溶液，而陽性對照組每天給予300 mg的別嘌呤醇片劑，連續(xù)30 d每天1次，每次10 mL/kg體重。在給藥的第2天、第7天和第14天測定肌酐、尿素氮和XOD的活性，并在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)采集血樣。在測試結(jié)束時(shí)，收集16個小時(shí)的尿液，并測量尿量和尿酸含量，稱重肝臟和右腎，腎臟用氦和尿酸鹽晶體染色進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.4.4 尿液采集

施用29 d后，收集動物16 h的尿液，測量尿量，并檢測尿酸含量。

1.4.5 血生化指標(biāo)檢測

在2 d、7 d和14 d，通過腹膜注射1.5 mL/kg體重的3%戊巴比妥鈉溶液，麻醉大鼠，然后眼眶靜脈竇采血，結(jié)束試驗(yàn)時(shí)腹主動脈采血，以3 000 r/min離心10 min后，分離血清并檢測血清肌酐、血清尿素氮、血尿酸和黃嘌呤氧化酶活性。

1.4.6 蘇木精-伊紅染色法(HE)染色觀察

選擇右邊的腎臟，采用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))中性甲醛進(jìn)行固定，常規(guī)石蠟包埋切片，最后進(jìn)行HE染色，并觀察。取左腎，無水乙醇固定，進(jìn)行尿酸特殊染色，觀察尿酸鹽結(jié)晶。

1.4.7 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

試驗(yàn)期間造模大鼠體型偏瘦，各大鼠大小便情況正常。與正常組相比，模型組大鼠體重在各稱重時(shí)間點(diǎn)均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，陽性對照組第31天的體重增加有顯著性差異(P<0.05)。

2.1 ATO對高尿酸大鼠模型臟器系數(shù)的影響

臟器系數(shù)能非常簡便地判斷出器官是否病變。在試驗(yàn)期間，將所有試驗(yàn)大鼠的肝臟和腎臟進(jìn)行了臟器系數(shù)分析，結(jié)果如表1所示。與正常對照組相比，模型對照組肝臟系數(shù)及右腎系數(shù)明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，說明用腺嘌呤溶液對大鼠進(jìn)行造模對肝腎是有一定損傷的。與模型對照組相比，低劑量組肝臟系數(shù)升高，陽性對照組右腎系數(shù)明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其余各組臟器系數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),說明高尿酸血癥大鼠在降酸藥和中、高劑量的ATO作用下，能讓肝臟和腎臟有一定程度的恢復(fù)。

表1 ATO對高尿酸大鼠模型的降尿酸作用研究期間各組大鼠臟器系數(shù)Table 1 The coefficient of ATO on lowering uric acid in rat model was studied during the study period

2.2 ATO對高尿酸大鼠XOD活性的影響

XOD主要位于肝臟，是催化次黃嘌呤產(chǎn)生尿酸的關(guān)鍵酶。這種酶主要存在于哺乳動物的肝臟中，但在正常人的血清中檢測不到或含量甚微。當(dāng)肝臟內(nèi)尿酸含量明顯增高時(shí)，XOD 釋放入血清[19]。因此，本文通過檢測血清XOD活性，可以評價(jià)ATO對尿酸生成的影響。從圖1可以看出，大鼠模型組和空白對照組相比，血尿酸濃度顯著升高(P<0.01)，XOD 活性顯著增加(P<0.01)，說明大鼠高尿酸血癥模型造模成功；相比于模型組，第7天時(shí)，ATO組和陽性藥物組的大鼠血尿酸濃度都有不同程度的降低，說明ATO能降低尿酸的生成量。第14天時(shí)，XOD含量有一個反彈上升，到第32天時(shí)，XOD含量回落，ATO 0.8 g/kg和1.6 g/kg劑量組與模型對照組有顯著性差異(P<0.05),這說明短期試驗(yàn)中，ATO的降尿酸功能比較明顯，但長期使用，ATO降尿酸功能不是很突出。

圖1 ATO對高尿酸大鼠模型的降尿酸作用研究期間各組大鼠血清XOD活性結(jié)果Fig.1 The results of serum XOD activity in rats of each group during the study of ATO′s effect on lowering uric acid in rat model with high uric acid注：采用重復(fù)測量方差分析的分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。與正常對照組比較，“▲”P<0.05,“▲▲”P<0.01;與模型對照組比較，“*”P<0.05,“**”P<0.01

2.3 ATO對高尿酸大鼠血液指標(biāo)的影響

為了進(jìn)一步研究ATO對高尿酸大鼠的降尿酸作用，在實(shí)驗(yàn)過程中測定了每只大鼠血清肌酐(serum creatinine, SCR)、血清尿素氮(serum urea nitrogen, BUN)和血尿酸(blood uric acid, BUA)含量，測定結(jié)果如圖2所示。SCR 與 BUN 是臨床評估腎臟損傷的常用指標(biāo)。腎臟受損會伴隨兩者水平升高[20]。從圖2-a可以看出，正常組的血清肌酐水平無明顯變化。與正常對照組相比，模型對照組血清肌酐含量在實(shí)驗(yàn)期間顯著升高(P<0.05)。與模型對照組相比，第2天ATO 2.4 g/kg高劑量組，第7天ATO1.6 g/kg和2.4 g/kg劑量組，第14天陽性對照組和ATO 3個實(shí)驗(yàn)劑量組的血清肌酐含量均顯著降低(P<0.05)，說明短期內(nèi)降尿酸效果顯著。第31天ATO 1.6 g/kg和0.8 g/kg劑量組SCR含量有所下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；由此可以看出ATO的低、中劑量在長時(shí)間的攝入后對降尿酸效果一般。由圖2-b可以得出，正常對照組在試驗(yàn)中，BUN水平基本沒有變化。與正常對照組相比，模型對照組在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，血清尿素氮含量明顯上升。與模型對照組相比，第2天高劑量組，第14天陽性對照組、ATO低、中、高劑量組血清尿素氮含量明顯降低(P<0.05)，說明降尿酸效果明顯。第31天 ATO低、中劑量組血清尿素氮含量有所下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，說明ATO的低、中劑量在長時(shí)間的攝入后對降尿酸的效果一般，這與SCR指標(biāo)的測定結(jié)果相一致。吳婷等[21-22]采用小鼠試驗(yàn)證實(shí)大麥葉粉具有防治高尿酸血癥的作用，其中試驗(yàn)組的SCR和BUN也呈現(xiàn)出此規(guī)律，說明持續(xù)的高尿酸可一定程度上引起腎臟損傷，陽性對照組(投喂別嘌呤醇)也并未使SCR和BUN降低，提示別嘌呤醇的長期使用可能對腎臟產(chǎn)生損傷。體內(nèi)次黃嘌呤和黃嘌呤在XOD的作用下生成BUA，從圖2-c中可以看出，造模成功的大鼠體內(nèi)BUA的含量是較高的，如攝入陽性藥物或者具有降尿酸功效的物質(zhì)，可通過抑制XOD的活性而減少BUA的水平[21]，在圖2-c，正常對照組的BUA是偏低的，陽性對照組和ATO的高、中、低劑量組整體呈下降的趨勢。與正常對照組相比，模型組在試驗(yàn)時(shí)期中，BUA顯著提升(P<0.05)。與模型組相比較，ATO的高劑量組在測定的4個時(shí)間節(jié)點(diǎn)中，血尿酸含量顯著降低(P<0.05),說明高劑量的ATO對大鼠的降尿酸療效較為顯著。

a-SCR;b-BUN;c-BUA圖2 ATO對高尿酸大鼠模型的降尿酸作用研究期間各組大鼠血液指標(biāo)結(jié)果Fig.2 Results of blood indexes in each group during the study of ATO′s effect on lowering uric acid in rat model with high uric acid注：采用重復(fù)測量方差分析的分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。與正常對照組比較“▲”P<0.05，“▲▲”P<0.01；與模型對照組比較，“*”P<0.05，“**”P<0.01

2.4 尿液指標(biāo)

高尿酸血癥主要是由于尿酸的產(chǎn)生(如攝入富含嘌呤的食物)與排泄(如腎功能降低)之間的不平衡造成的[22]。無論產(chǎn)生多少尿酸，如果排泄量少，體內(nèi)的尿酸水平會不斷積累和上升，從而導(dǎo)致高尿酸血癥及其并發(fā)癥。試驗(yàn)期間，檢測實(shí)驗(yàn)各組的尿液量和尿酸濃度，計(jì)算尿酸排泄量，結(jié)果如表2所示。與正常對照組相比，模型對照組的尿酸濃度、尿量和尿酸排泄量均顯著降低(P<0.01)，表明尿酸在實(shí)驗(yàn)期間在高尿酸血癥大鼠體內(nèi)積累。與模型對照組相比，陽性對照組與ATO實(shí)驗(yàn)組在這3項(xiàng)指標(biāo)上無顯著性差異。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)過程中，大鼠體內(nèi)尿酸排泄量減少。

2.5 ATO對高尿酸血癥大鼠腎臟組織病理學(xué)的影響

通過觀察大鼠腎臟病理切片，從細(xì)胞層面比較各組腎臟損傷情況，進(jìn)而判斷ATO對腎臟受損的高尿酸血癥大鼠的影響[23]。如圖3所示，正常組腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常，無病理改變；模型組腎小管細(xì)胞輕度脂肪變性，腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂肪空泡，表明模型藥物對腎小管上皮細(xì)胞有嚴(yán)重?fù)p傷。與模型組相比，陽性對照組腎小管上皮細(xì)胞的脂肪泡變小，細(xì)胞核向細(xì)胞一側(cè)擠壓，管腔變窄，說明別嘌呤醇在治療高尿酸血癥時(shí)對腎臟造成了一定的損害；這與席圓圓等[24]研究的鐵觀音水提物對高尿酸小鼠的腎臟組織病理結(jié)果相一致。ATO的高、中、低劑量組腎小管上皮細(xì)胞正常，只見少量脂肪變性，與模型組比較，脂肪空泡較小、較少，病變輕微，大部分腎小管結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常；但ATO的各實(shí)驗(yàn)組之間并沒有明顯的差異,表明高尿酸血癥大鼠腎臟修復(fù)中ATO的量效關(guān)系不明顯。

表2 試驗(yàn)期間各組大鼠尿液指標(biāo)結(jié)果Table 2 Urine index results of rats in each group during the experiment

a-正常對照組;b-模型對照組;c-陽性對照組;d-ATO低劑量組;e-ATO中劑量組;f-ATO高劑量組圖3 各實(shí)驗(yàn)組腎臟組織病理學(xué)檢查Fig.3 Histopathological examination of kidney in each experimental group

尿酸在血液中的溶解度極低，當(dāng)血清尿酸水平超過其物理溶解度(約7 mg/dL)，通過與 IgM、IgA、IgG等抗體結(jié)合，或形成尿酸鹽結(jié)晶(monosodium uratecrystals，MSU)。MSU沉聚在人體血管中最內(nèi)層的表皮，不僅可以增加白細(xì)胞對最內(nèi)層表皮細(xì)胞的黏著程度，還可以提升人體體內(nèi)的炎癥細(xì)胞因子成分的存活性，同時(shí)我們血管內(nèi)部的細(xì)胞膜炎性破損。當(dāng)尿液中的尿酸上升到一定的指標(biāo)時(shí)，尿酸鹽就會結(jié)成晶體分解出來，沉聚在血管細(xì)胞的內(nèi)壁，從而造成部分炎性癥狀的出現(xiàn)，所以會在一定程度上破壞細(xì)胞血管內(nèi)層表皮，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化和損傷，也會導(dǎo)致內(nèi)層的細(xì)胞表皮生成較多的帶炎癥的成分，造成嚴(yán)重的不良重復(fù)。尿液中的尿酸鹽成分會引起內(nèi)皮細(xì)胞起反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)濃度是1 184 μmol/L，伴著尿酸鹽含量的不斷提升，內(nèi)層表皮細(xì)胞分子所產(chǎn)生的帶有炎性癥狀因子的成分也不斷提高，尿酸鹽的含量達(dá)到一定的程度時(shí)，炎癥因子的生成會到達(dá)一個瓶頸，提示高濃度的尿酸鹽的細(xì)胞毒性較大，可引起細(xì)胞凋亡，造成細(xì)胞死亡[25-26]。從圖4可以看出，相比正常對照組，其他各實(shí)驗(yàn)組都有大量尿酸鹽沉積的現(xiàn)象，其中模型對照組較為顯著，陽性對照組和ATO各試驗(yàn)組差異性不明顯，說明別嘌呤醇和ATO在一定程度降低了尿酸的生成，減少了MSU的沉積。

a-正常對照組;b-模型對照組;c-陽性對照組;d-ATO低劑量組;e-ATO中劑量組;f-ATO高劑量組圖4 各實(shí)驗(yàn)組尿酸鹽染色檢查Fig.4 Examination urate staining in each experimental group

3 結(jié)論

采用高尿酸血癥大鼠模型評價(jià)ATO降尿酸功效，通過血液XOD、血液指標(biāo)、尿液指標(biāo)測定結(jié)果和腎組織切片病理變化觀察表明，ATO能抑制XOD酶的活性，減少尿酸的生成和尿酸鹽晶體的沉積，因此具有降低血尿酸的作用。研究結(jié)果為扁舵鰹魚低聚肽降尿酸產(chǎn)品開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)，也為扁舵鏗魚的高值化利用提供了技術(shù)基礎(chǔ)。