楊娟,羅瑋倩,何曼源

1(嶺南師范學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 湛江，524048)2(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州，510641)

大豆蛋白是一種性價(jià)比高、富有營(yíng)養(yǎng)的產(chǎn)品。雖然我國(guó)食用豆制品已有悠長(zhǎng)歷史，但由于大豆蛋白屬于球蛋白，其結(jié)構(gòu)保守，聚集的驅(qū)動(dòng)力多以疏水作用、氫鍵等物理相互作用為主，聚集體結(jié)構(gòu)無(wú)序，凝膠強(qiáng)度不足，二硫鍵含量低，使得制備的大豆蛋白凝膠等食品易出現(xiàn)口感粗糙，滋味不足，結(jié)構(gòu)松散的現(xiàn)象，由大豆蛋白制成的凝膠食品不能提供具有彈性的、堅(jiān)韌的口感質(zhì)構(gòu)[1-4]。解決該問題可通過選擇性混合二硫鍵含量豐富的蛋清蛋白于其中，制出一種高蛋白、風(fēng)味口感俱佳的植物蛋白和動(dòng)物蛋白混合物。蛋清蛋白富含二硫鍵，可形成以共價(jià)鍵支撐的凝膠網(wǎng)絡(luò)，賦予凝膠良好的口感質(zhì)構(gòu)及持水性[5-7]。利用其成膠特性，使其作為大豆蛋白熱致凝膠過程中游離巰基的供體，使復(fù)合體系可形成更多二硫鍵，最終達(dá)到改善大豆蛋白凝膠結(jié)構(gòu)和質(zhì)構(gòu)的目的。本文研究大豆分離蛋白(soy protein isolate，SPI)與蛋清蛋白(egg albumin，EA)及其復(fù)合體系間的差異，利用萬(wàn)能材料機(jī)考察其成膠性能、掃描電子顯微鏡(scanning electronicmicroscope，SEM)觀察其微觀結(jié)構(gòu)并分析其持水性能，了解不同條件下單一大豆蛋白體系和大豆蛋白/蛋清蛋白復(fù)合體系凝膠的狀態(tài)，從而為選擇性混合大豆蛋白與蛋清蛋白的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供思路和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蛋清蛋白，Sigma公司；低溫脫脂大豆粕，山東御馨生物科技公司；Folin-酚試劑盒，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑皆為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CR22G高速冷凍離心機(jī)，日本Hitachi公司；Alpha-4冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ公司；RW 20頂置式攪拌器、T25分散均質(zhì)機(jī)，德國(guó)IKA公司；Zeiss EVO18臺(tái)式掃描電子顯微鏡，德國(guó)Carl Zeiss；Genesys 10 s分光光度計(jì)，美國(guó)Therom Fisher公司；5943萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)，美國(guó)Instron公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備

采用WANG等[8]的方法制備大豆分離蛋白。

1.3.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳

通過SDS-PAGE考察大豆蛋白及蛋清蛋白原料的蛋白組成[9-10]。配制分離膠緩沖液(1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8)、濃縮膠緩沖液(0.5 mol/L Tris-HCl pH 6.8)、30%(體積分?jǐn)?shù))單體貯液、10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS、電泳緩沖液。分離膠由10 mL分離膠緩沖液、17 mL 30%單體貯液、0.4 mL 10% SDS、12.4 mL去離子水加250 μL 過硫酸銨(ammonium persulfate,AP)后迅速搖晃，再迅速加入25 μL 四甲基乙二胺四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine,TEMED)組配。濃縮膠由5 mL濃縮膠緩沖液、3.4 mL 30%單體貯液、0.2 mL 10%SDS、11.4 mL去離子水、加120 μL AP后迅速搖晃再加10 μL TEMED組配。Marker上樣量7μL，蛋白樣品(質(zhì)量濃度2.5 mg/mL)上樣量10 μL。

1.3.3 蛋清蛋白溶解性

采用Folin-酚試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 成膠性能測(cè)定

配制8 mL 2%～12%(體積分?jǐn)?shù))的蛋清蛋白溶液、8 mL 10%～15%(體積分?jǐn)?shù))的SPI蛋白溶液、8 mL 10%～15%的大豆蛋白/蛋清蛋白復(fù)合溶液(質(zhì)量比為4∶1)并調(diào)至pH 5.5，置于95 ℃水浴30 min，冰水冷卻至室溫。將凝膠樣品切成長(zhǎng)度為10 mm、直徑為14.36 mm的截面平整的圓柱體，利用萬(wàn)能材料機(jī)測(cè)定質(zhì)地剖面分析(texture profile analysis,TPA)曲線，選用直徑為25 mm的探頭，速度均為1 mm/s，形狀采用絕對(duì)斜線段，凝膠壓縮強(qiáng)度為30%，首次壓縮后探針停滯保持1 s后進(jìn)行二次壓縮，TPA曲線最高峰點(diǎn)對(duì)應(yīng)凝膠硬度[4,11]。另考察pH 7.0和pH 5.5時(shí)的凝膠成膠性能以及等電點(diǎn)成膠的優(yōu)勢(shì)。

1.3.5 持水性測(cè)定

(1)

1.3.6 微觀結(jié)構(gòu)

配制60 mL 5%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛溶液，混合60 mL 40 mmol/L的磷酸緩沖液作為固定液使用。將制好的凝膠固定過夜，然后用20 mmol/L的磷酸緩沖液漂洗3次，以30%～100%不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)凝膠進(jìn)行梯度脫水10 min并切薄片，置于導(dǎo)電膠上，噴金處理后在掃描電鏡10 kV條件下觀察[13-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)的組成

經(jīng)分析，2種蛋白質(zhì)條帶對(duì)應(yīng)的類別如圖1所示。

圖1 SPI與EA的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE image of SPI and EA

2.3.2 蛋清蛋白溶解性

蛋清蛋白于pH 8.0條件的溶解度最高，隨著pH下降，在pH 5.0時(shí)溶解度達(dá)到最低。呈現(xiàn)典型的蛋白質(zhì)溶解度曲線。SPI在pH 4.5處達(dá)到等電點(diǎn)，二者等電點(diǎn)接近。選擇pH 5.5即接近兩者等電點(diǎn)處作為成膠條件可使凝膠強(qiáng)度相對(duì)較強(qiáng)[15-16]。

圖2 pH 2～8時(shí)100 μg/mL EA溶液溶解度Fig.2 Solubility of 100 μg/mL EA solution at pH 2-8注：不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.3.3 蛋清蛋白及大豆蛋白/蛋清蛋白復(fù)合體系成膠性能

2%～12%的EA、10%～15%的SPI和SPI+EA加熱后所形成的凝膠形態(tài)如圖3所示。

a-5%～12%的EA凝膠形態(tài);b-10%～15%的SPI凝膠形態(tài);c-10%～15%SPI+EA凝膠形態(tài)圖3 蛋白濃度為2%～12%的EA、蛋白濃度為10%～15%的SPI和SPI+EA凝膠形態(tài)Fig.3 Morphology of EA gel with 2%-12% protein content,SPI gel with 10%-15% protein content and SPI+EA composite gel

EA溶液，體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí)難以成膠。溶液體積分?jǐn)?shù)為4%可形成結(jié)構(gòu)仍然不緊致凝膠，無(wú)法切塊后直立。溶液體積分?jǐn)?shù)為5%及以上，凝膠結(jié)構(gòu)和質(zhì)地良好且強(qiáng)度隨蛋清蛋白濃度的增加逐漸升高[16-17]。10%～15%的SPI溶液加熱后可形成完好凝膠，但凝膠結(jié)構(gòu)仍不緊致。凝膠結(jié)構(gòu)強(qiáng)度隨大豆蛋白濃度增加逐漸升高，形狀更加完整，質(zhì)地愈來(lái)越硬。10%～15%的SPI+EA復(fù)合溶液加熱后形成的凝膠結(jié)構(gòu)強(qiáng)度隨著SPI+EA蛋白濃度的增加逐漸升高，其質(zhì)地也越來(lái)越硬。相比于單純的大豆蛋白凝膠，同一濃度復(fù)合凝膠結(jié)構(gòu)的完整性及質(zhì)地有明顯的優(yōu)勢(shì)。TPA曲線分別對(duì)應(yīng)5%～12%的蛋清蛋白凝膠。溶液濃度為6%及以上時(shí)，凝膠硬度逐漸上升，逐漸形成了結(jié)構(gòu)良好、完整的圓柱體，即凝膠硬度隨著蛋清蛋白濃度的增加而上升，趨勢(shì)明顯。同一濃度和處理?xiàng)l件下，添加了蛋清蛋白后的復(fù)合體系形成的凝膠結(jié)構(gòu)更緊密，質(zhì)地硬度更高，成膠性能大大提升。

圖4 蛋白濃度為5%～12%的EA、蛋白濃度為10%～15%的SPI以及SPI+EA凝膠硬度Fig.4 Hardness of EA gel with 5%-12% protein content, SPI gel with 10%-15% protein content and SPI/ EA composite gel

2.3.4 蛋清蛋白持水性

不同濃度蛋清蛋白間的持水性能差異如圖5所示。在5%～12%，隨EA溶液濃度的增加，其持水性能提高。更多蛋白加入到凝膠網(wǎng)絡(luò)中帶來(lái)更多的親水基團(tuán)，將更多的水束縛在網(wǎng)絡(luò)內(nèi)。隨著蛋白濃度增加，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增強(qiáng)，網(wǎng)絡(luò)內(nèi)可承載水分量增加。隨著SPI和SPI+EA復(fù)合體系濃度的增加，體系的持水性逐步加強(qiáng)。相比于同一濃度的單一SPI溶液體系，復(fù)合體系的持水性具有優(yōu)勢(shì)，蛋清蛋白的加入不僅能夠增加二硫鍵來(lái)改善蛋白凝膠的硬度，還能鎖住更多的水分。

圖5 蛋白濃度為5%～12%的EA、5%～12%的SPI及SPI+EA凝膠持水性Fig.5 Water holding capacity of EA gel with 5%-12% protein content, SPI gel with 10%-15% protein content and SPI+EA composite gel

2.3.5 蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)

通過SEM觀察到的微觀結(jié)構(gòu)如圖6所示。凝膠網(wǎng)絡(luò)是由多個(gè)聚集體小球組裝成凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)，在濃度較低時(shí)，EA復(fù)合凝膠疏松，孔隙和顆粒更多，在濃度較高時(shí)，蛋白體系形成了結(jié)構(gòu)緊密的狀態(tài)。隨著蛋白體系濃度的增加，凝膠微觀結(jié)構(gòu)從疏松過渡為致密，凝膠機(jī)械強(qiáng)度由此提升，顆粒數(shù)的明顯降低和越來(lái)越致密網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)致了凝膠持水性的提高。濃度相同時(shí)，在濃度較低時(shí)，純SPI凝膠較SPI+EA復(fù)合凝膠疏松，孔隙和顆粒更多，在濃度較高時(shí)，2種蛋白體系都形成了結(jié)構(gòu)緊密的狀態(tài)。蛋白濃度低時(shí)，SPI網(wǎng)絡(luò)是顆粒球堆砌起來(lái)，而加了蛋清蛋白以后，有了更多共價(jià)鍵參與網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，EA融入了SPI網(wǎng)絡(luò)，形成了更清晰的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使蛋白網(wǎng)絡(luò)更致密，因而改善凝膠的硬度和持水性。

a-EA 5%;b-EA 6%;c-EA 7%;d-EA 8%;e-EA 9%;f-EA 10%;g-EA 11%;h-EA 12%;i-SPI 10%;j-SPI+EA 10%;k-SPI 11%;l-SPI+EA 11%;m-SPI 12%;n-SPI+EA 12%;o-SPI 13%;p-SPI+EA 13%;q-SPI 14%;r-SPI+EA 14%;s-SPI 15%;t-SPI+EA 15%圖6 蛋白濃度為5%～12%的EA以及10%～15%的SPI與SPI+EA微觀結(jié)構(gòu)Fig.6 Microstructure of SPI gel, SPI+EA composite gel with 10%-15% protein content and EA gel with 5%-12% protein content

2.3.6 不同pH下蛋白體系成膠性能

對(duì)比10%濃度下不同pH和不同構(gòu)成的蛋白溶液加熱后形成的凝膠的成膠性能，結(jié)果如圖7所示。

10% pH 7.0 EA溶液熱處理可以形成質(zhì)地良好的凝膠，相比于相同條件下SPI與EI復(fù)合溶液所形成的凝膠硬度更高，主要源于蛋白在相對(duì)較高pH下，熱處理可形成更多二硫鍵，所形成凝膠的質(zhì)地結(jié)構(gòu)更好，而pH較低時(shí)，二硫鍵則形成得少[18]。pH 7.0的SPI+EA復(fù)合溶液的持水性效果最佳，可見混合SPI可以提高蛋白體系的持水性能。選擇pH 5.5作為凝膠條件，接近兩者等電點(diǎn)，可以使凝膠的強(qiáng)度相對(duì)較強(qiáng)，但持水性比pH 7.0時(shí)相對(duì)較差，因?yàn)榇藭r(shí)接近等電點(diǎn)，蛋白與水的相互作用相對(duì)弱一些。10% pH 7.0時(shí)SPI+EA復(fù)合凝膠相比于10% pH 7.0相同條件的EA凝膠更加致密、平整，因?yàn)樾纬闪送暾?、質(zhì)地緊致的透明狀凝膠，水分含量極高，蛋白固體沉淀很少。在10% pH 5.5時(shí)，SPI+EA復(fù)合凝膠結(jié)構(gòu)相比之下疏松許多，顆粒數(shù)明顯增加。

a-硬度、凝膠形態(tài)；b-持水性、微觀結(jié)構(gòu)圖7 蛋白凝膠硬度、蛋白凝膠形態(tài)、持水性和微觀結(jié)構(gòu)Fig.7 Hardness, gel morphology, water holding capacity and microstructure of protein gel

3 結(jié)論與討論

純大豆蛋白形成的凝膠二硫鍵含量很少，凝膠結(jié)構(gòu)疏松，與蛋清蛋白相比，相差比較遠(yuǎn)，在大豆蛋白溶液中添加蛋清蛋白溶液(質(zhì)量比為4∶1)，可以增加所形成的凝膠中含有的二硫鍵，從而增加凝膠的硬度，使其擁有良好的質(zhì)地，微觀形貌體現(xiàn)了凝膠結(jié)構(gòu)從疏松過渡為致密，顆粒數(shù)明顯降低。此外，添加了蛋清蛋白所形成的凝膠的持水性能也有所改善。

蛋白在相對(duì)較高pH下，熱處理可形成更多二硫鍵，而pH較低時(shí)，二硫鍵則形成得少[19-20]。當(dāng)pH 7.0時(shí)10%純大豆蛋白溶液無(wú)法形成凝膠，當(dāng)添加了蛋清蛋白質(zhì)之后可以形成具有良好結(jié)構(gòu)和持水性更好的凝膠。隨著蛋白濃度增加，蛋白質(zhì)相互接觸的機(jī)會(huì)增加，疏水作用增強(qiáng)，更易形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，且結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度和持水性能隨之增加。利用蛋清蛋白作為大豆蛋白熱致凝膠過程中游離巰基的供體，可使復(fù)合體系可形成更多二硫鍵，在提升硬度的同時(shí)增加也能其持水性，賦予凝膠良好的質(zhì)構(gòu)。