肖葉，葉精勤，閻俊，施文正，盧瑛*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306) 3(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，上海，201306)

由水產(chǎn)食物引發(fā)的過敏性疾病作為重要的食品安全問題受到越來越多的關(guān)注，水產(chǎn)品的過敏反應(yīng)由水產(chǎn)品本身或水產(chǎn)品接觸的各種非水產(chǎn)成分(包括各種污染物，如寄生蟲、細(xì)菌、化學(xué)添加劑等)引起[1]。近些年來，水產(chǎn)品生產(chǎn)量和貿(mào)易出口量不斷增加，由其引發(fā)的過敏性疾病發(fā)病率持續(xù)上升，給食物過敏患者的身體健康造成了威脅[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，亞洲兒童食物過敏人群中，甲殼類水產(chǎn)品引發(fā)的過敏反應(yīng)占39%，魚類占13.2%；而在成人中，甲殼類、軟體類水產(chǎn)品的過敏反應(yīng)引發(fā)率分別為33.8%、18.9%[3-4]。由此可見，水產(chǎn)品引發(fā)食物過敏是我們必須重視的食品安全問題。

食物過敏在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被習(xí)慣性稱作變態(tài)反應(yīng)，指外來抗原首次接觸機(jī)體，機(jī)體免疫細(xì)胞分泌相應(yīng)的抗體來抵抗抗原的刺激，當(dāng)同一種抗原再次刺激機(jī)體，細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)，組織發(fā)生損傷或生理機(jī)能出現(xiàn)障礙[5]。目前還沒有有效的措施來治療食物過敏，只能通過人為避免接觸過敏原或在食品生產(chǎn)過程中，選用合適的加工技術(shù)消減致敏蛋白的致敏性。常見的食品加工技術(shù)按其作用原理可分為物理加工法、化學(xué)修飾法和生物處理法三大類，但熱處理[6]、輻照技術(shù)[7]、超聲波[8]等物理方法需特定的設(shè)備且消減效果一般，還會(huì)對食品品質(zhì)造成影響；糖基化修飾[9]、強(qiáng)酸[10]、強(qiáng)堿水解[11]等化學(xué)方法處理過程較復(fù)雜，條件較難掌控，需要一定成本，且會(huì)降解其他蛋白質(zhì)并影響食物口感；而酶改性[12]、發(fā)酵[13]、基因改良[14]等生物加工技術(shù)成本低，操作簡便，在不破壞營養(yǎng)品質(zhì)的基礎(chǔ)上可改善食品特性，因此被廣泛應(yīng)用于食品加工行業(yè)，成為過敏原消減領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)。本文綜述了酶改性、發(fā)酵、基因改良等生物加工技術(shù)及其優(yōu)缺點(diǎn)，概括了利用生物加工技術(shù)消減水產(chǎn)品過敏蛋白致敏性的研究現(xiàn)狀以及消減機(jī)制，以期為今后利用生物加工技術(shù)開發(fā)低致敏性水產(chǎn)加工食品提供理論指導(dǎo)。

1 水產(chǎn)品的主要過敏原

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對食用水產(chǎn)品引起的過敏反應(yīng)的研究不斷深入，常見的含有致敏蛋白的水產(chǎn)食物有硬骨魚類、甲殼類、貝類及一些軟體動(dòng)物[15]。硬骨魚類的主要致敏蛋白為小清蛋白(parvalbumin, PV)，它富含于魚類的肌肉組織中，在水中溶解度極高，在高溫與酶的作用下不易被破壞，包括α和β兩種類型，分子質(zhì)量約12 kDa，且不同種類魚肉中的PV同源性較高[16-17]。農(nóng)小獻(xiàn)等[18]通過 X-射線衍射譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)鯉魚PV的三級(jí)結(jié)構(gòu)中有 6 個(gè) α 螺旋,且它們兩兩結(jié)合成相同的蛋白體。甲殼類、貝類及軟體動(dòng)物的主要致敏蛋白為原肌球蛋白(tropomyosin, TM))、精氨酸激酶(arginine kinase, AK)和肌鈣結(jié)合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein，SCP)[19-20]。TM廣泛存在于甲殼類水產(chǎn)品和蛤蜊、貽貝等軟體動(dòng)物的肌肉或非肌肉組織中，它的超螺旋結(jié)構(gòu)中含有7個(gè)交互的肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，相對分子質(zhì)量在32～40 kDa，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且耐高溫[21]。AK最早發(fā)現(xiàn)于貝類水產(chǎn)品中，主要以單體形式存在，極少情況以二聚體形式被發(fā)現(xiàn)。AK結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有研究表明，斑節(jié)對蝦AK的N端結(jié)構(gòu)域包含α-螺旋，而C端結(jié)構(gòu)域由α-螺旋和β-折疊混合組成[22]。它的分子質(zhì)量為40 kDa左右，與原肌球蛋白的不同之處在于，AK不耐熱，在熱的作用下，AK會(huì)形成多聚體[23]。SCP最早在斑節(jié)對蝦和太平洋白蝦中被發(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量大約在20 kDa，它的結(jié)構(gòu)和功能與脊椎動(dòng)物體內(nèi)PV的結(jié)構(gòu)和功能相似性極高。有報(bào)道稱，SCP 具有多態(tài)性(SCP-I, SCP-II和SCP-III)，其中SCP-I和SCP-III與IgE的結(jié)合能力比SCP-II大[24]。

此外，肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)[25]、肌鈣蛋白(troponin C，TnC)[26]、血藍(lán)蛋白(hemocyanin，HMC)[27]、磷酸丙糖異構(gòu)酶(triosephosphate isomerase，TPI)[28]、魚類膠原蛋白[29]、烯醇酶和肌酸激酶[30]等也相繼被國內(nèi)外研究人員確認(rèn)為水產(chǎn)品的新型過敏原。表1列舉了常見水產(chǎn)品的主要過敏蛋白及來源品種，具體如下：

表1 常見的水產(chǎn)品過敏蛋白Table 1 Common allergic proteins in aquatic products

2 生物加工技術(shù)對水產(chǎn)品過敏原致敏性的消減研究

以“enzyme，aquatic products, allergy”、“fermentation，aquatic products, allergy”、“genetic modification，aquatic products, allergy”分別為關(guān)鍵詞，在web of science中共檢索到2 995篇文獻(xiàn)，其中利用生物加工技術(shù)消減硬骨魚類過敏原致敏性的發(fā)表文章數(shù)為1 980篇，甲殼類和貝類為728篇，而利用生物加工技術(shù)消減軟體動(dòng)物類過敏原致敏性的發(fā)表文章數(shù)較少，僅287篇。近五年發(fā)表文章數(shù)占全部檢索文獻(xiàn)的25%，其中硬骨魚類占15.1%，甲殼類和貝類占8.2%，軟體動(dòng)物類占1.7%，且總體來說，利用生物加工技術(shù)消減水產(chǎn)品過敏原致敏性的文章發(fā)表數(shù)呈現(xiàn)逐年遞增趨勢(圖1)。這些數(shù)據(jù)表明，近些年來，生物加工技術(shù)對水產(chǎn)品過敏原致敏性的消減研究已經(jīng)引發(fā)了科研人員極大的興趣，成為了當(dāng)前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

圖1 年份-文章發(fā)表數(shù)Fig.1 Year-article publications

2.1 酶改性技術(shù)

酶改性技術(shù)的原理是致敏蛋白被蛋白酶水解成多肽或氨基酸等小分子物質(zhì)，或蛋白質(zhì)在酶的作用下發(fā)生分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)反應(yīng)從而促使蛋白的交聯(lián)聚合，致敏蛋白的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，致敏性會(huì)隨之發(fā)生改變[31]。MEJRHIT等[32]研究在消化液中蝦原肌球蛋白的致敏性是否穩(wěn)定存在，間接ELISA和斑點(diǎn)免疫印跡結(jié)果表明，原肌球蛋白在人工胃液中極其不穩(wěn)定，在胃蛋白酶水解作用下顯示出IgE結(jié)合能力的下降，這可能是因?yàn)樵∏虻鞍椎目臻g結(jié)構(gòu)在蛋白酶的作用下發(fā)生了變化，造成其致敏性的改變。TIAN等[33]評(píng)價(jià)在不存在和存在咖啡酸的情況下，與酪氨酸酶(tyrosinase,Tyr)交聯(lián)后，大菱鲆的PV與IgG結(jié)合能力的變化，SDS-PAGE結(jié)果顯示，在交聯(lián)的PV中出現(xiàn)了更高的分子質(zhì)量譜帶(24，36 kDa)且交聯(lián)PV的二級(jí)結(jié)構(gòu)變得松散無序。蛋白免疫印跡和間接ELISA觀察到在Tyr處理后PV帶的強(qiáng)度降低，交聯(lián)PV的IgG結(jié)合能力降低了34.94%，熒光和紫外線吸收光譜分析也顯示酶法交聯(lián)后PV結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，結(jié)構(gòu)的改變影響了PV的免疫活性。王學(xué)麗等[34]模擬TM的胃腸消化，采用質(zhì)譜技術(shù)分析消化產(chǎn)物中氨基酸組成和序列是否發(fā)生變化，發(fā)現(xiàn)胃腸消化2 h 后，雖仍存在 3 個(gè)不被破壞的抗原表位(肽段 111～125、137～141、153～161)和 4 個(gè)抗消化能力很強(qiáng)的抗原表位(肽段 50～66、144～151、145～164、150～163)，但胃蛋白酶會(huì)破壞TM 的大部分抗原表位，對其致敏性產(chǎn)生一定影響。由此可見，酶改性技術(shù)利用蛋白酶的水解作用或酶促交聯(lián)反應(yīng)，使得致敏蛋白的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，氨基酸組成與序列發(fā)生改變，致敏表位遭到破壞，其致敏性由此發(fā)生變化。

2.2 發(fā)酵技術(shù)

利用乳酸菌發(fā)酵是當(dāng)前應(yīng)用較多的一種食品加工工藝，難溶解的大分子物質(zhì)在乳酸菌分泌物的作用下分解為易溶的小分子物質(zhì)[35]，通過改變食品中各組分的占比，使致敏蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生變化，致敏性隨之改變。乳酸菌還可以調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥因子的釋放，提升血清中IgA、IgM的水平[36]，調(diào)節(jié)CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的占比分配，改善腸道菌群的失衡狀態(tài)進(jìn)而提高機(jī)體免疫能力，緩解食物過敏引起的不良反應(yīng)[37]。高卿等[38]利用木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus，Sx)發(fā)酵海鱸魚，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，海鱸魚中的大量蛋白質(zhì)發(fā)生降解，雖發(fā)酵初期降解效果不明顯，但發(fā)酵60 h后PV的IgG、IgE結(jié)合能力分別下降了26.9%、22.3%，IgG、IgE結(jié)合能力的變化與PV空間結(jié)構(gòu)的變化有密不可分的關(guān)系。傅玲琳等[39]通過體外實(shí)驗(yàn)研究5 種乳酸菌對小鼠致敏性的影響差異，發(fā)現(xiàn)其中芽孢乳酸菌 09.712對小鼠的抗過敏能力最強(qiáng)，利用體內(nèi)檢測法測定芽孢乳酸菌09.712治療前后的致敏小鼠血清中特異性抗體、脾臟T淋巴細(xì)胞亞群等的含量變化，研究乳酸菌緩解食物過敏的免疫調(diào)節(jié)機(jī)理，結(jié)果表明，Th0細(xì)胞的分化受到芽孢乳酸菌的調(diào)控，它有利于Th1和Treg細(xì)胞的生成，而Th2細(xì)胞的生成受到抑制，IFN-γ等抗炎因子分泌量激增并被大量表達(dá)出來，這樣有利于調(diào)節(jié)Th1/Treg/Th2的動(dòng)態(tài)免疫平衡，從而減少過敏原對小鼠腸黏膜的刺激，這可能是其抑制過敏反應(yīng)的機(jī)理之一。由此可見，乳酸菌不僅可以將大分子蛋白降解為小分子肽或氨基酸，還可以通過改善腸道菌群的失衡狀態(tài)，調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放，增強(qiáng)機(jī)體對外來致敏食物的免疫力，進(jìn)而改善機(jī)體的過敏癥狀。

2.3 基因改良

基因改良技術(shù)是近年來迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)新型生物技術(shù),這項(xiàng)技術(shù)從生物遺傳學(xué)的角度出發(fā)，聚焦于引發(fā)過敏反應(yīng)的源頭物質(zhì)，通過改良或消除關(guān)鍵抗原表位的編碼基因，使改良后的編碼基因不能按照原先的方式參與蛋白表達(dá)過程，從而影響其致敏性。有研究表明, 反義技術(shù)可以達(dá)到改良或消除抗原表位的編碼基因的目的，如首先在體外人工合成一條短鏈RNA，然后將其導(dǎo)入體內(nèi)，它會(huì)對同源互補(bǔ) mRNA起到降解作用，因此致敏基因會(huì)發(fā)生改變。另一種方法的原理為體內(nèi)特異性基因的表達(dá)被人工導(dǎo)入的基因片段所抑制，這兩種方法都可以改良致敏蛋白的編碼基因，進(jìn)而影響其致敏性[40]。

REESE等[41]通過誘發(fā)突變實(shí)驗(yàn)改變蝦過敏原的表位組成，消減其致敏性，首先采用測試分析手段選定了5個(gè)可以識(shí)別IgE反應(yīng)的關(guān)鍵致敏表位以及幾個(gè)對IgE Ab結(jié)合能力具有較大影響的氨基酸位置，在此基礎(chǔ)上，利用非過敏性脊椎動(dòng)物的原肌球蛋白把蝦過敏原的IgE識(shí)別肽替換掉，測試替換前后它們與IgE Ab的反應(yīng)能力差異，然后將其關(guān)鍵IgE表位斷開，再重新組合一個(gè)新的蛋白VR9-I，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘變后的過敏原蛋白的氨基酸序列出現(xiàn)變化，免疫反應(yīng)性明顯降低，致敏性降低了98%；WAI等[14]通過定點(diǎn)誘變和表位缺失兩種技術(shù)方法改變TM的表位組成與結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，當(dāng)TM已知的8個(gè)表位被除去或者被魚的相應(yīng)氨基酸序列替換后，TM致敏性會(huì)發(fā)生明顯變化。由此可見，基因改良技術(shù)可以將過敏原的關(guān)鍵致敏表位破壞或者改變，表位致敏性發(fā)生變化，且基因改良技術(shù)通過改變過敏原的線性表位和構(gòu)象表位組成比例，產(chǎn)生新的氨基酸序列，影響了抗原表位的表達(dá)過程[42]，從而達(dá)到改變致敏性的目的。

3 各生物加工技術(shù)對過敏原消減作用的比較

目前已知的用于消減過敏原致敏性的生物加工技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)見表2。酶改性技術(shù)反應(yīng)條件溫和, 不會(huì)損壞食品中的其他物質(zhì)特別是營養(yǎng)元素, 還有可能產(chǎn)生一些具有特殊生理功能的活性肽，但酶改性效果受到酶種類、酶改性條件等因素的共同影響, 因此可能會(huì)產(chǎn)生一些降低食品風(fēng)味體驗(yàn)的物質(zhì)，如苦味肽；微生物發(fā)酵法降低食物致敏性并不是適合于所有的過敏食物，但發(fā)酵處理后的食品，營養(yǎng)成分不會(huì)被破壞，還有助于各類營養(yǎng)物質(zhì)被人體最大程度化吸收；基因改良技術(shù)可以改變抗原表位組成，高效消減過敏原致敏性，但可能會(huì)引入新的抗原決定簇，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生其他不良反應(yīng)；聯(lián)合技術(shù)雖消減過敏原致敏性的效率很高，但操作較復(fù)雜，且可能會(huì)影響風(fēng)味。

表2 生物加工技術(shù)對致敏蛋白消減作用比較Table 2 Comparison of the reduction effect of bioprocessing technology on allergenic proteins

4 展望

隨著水產(chǎn)品市場的不斷擴(kuò)大，食物過敏反應(yīng)日趨嚴(yán)重和復(fù)雜，因此水產(chǎn)品過敏原致敏性的消減受到越來越多學(xué)者的關(guān)注。但目前的研究主要集中在采用不同食品加工技術(shù)消減硬骨魚類及甲殼類水產(chǎn)品中過敏原的致敏性，對其消減機(jī)理的研究較少，且涉及到機(jī)理研究的多為物理和化學(xué)消減方法，而生物加工技術(shù)對過敏原致敏性的消減機(jī)理研究甚少。因此，在今后的研究中，有必要深入研究生物加工技術(shù)對過敏原致敏性的消減作用機(jī)制，如生物加工技術(shù)影響過敏原致敏性的作用方式，生物加工技術(shù)消減過敏原致敏性的過程中，過敏原結(jié)構(gòu)具體發(fā)生了哪些變化，哪些抗原表位遭到了破壞，關(guān)鍵致敏表位是否發(fā)生改變，表位變化與其氨基酸序列組成有何關(guān)系，結(jié)構(gòu)變化及表位變化與致敏性變化的構(gòu)效關(guān)系。此外，在之后的研究中，我們應(yīng)該將目前成熟的生物消減技術(shù)更多的利用在軟體動(dòng)物致敏性的消減研究中，為今后利用生物加工技術(shù)開發(fā)低致敏性水產(chǎn)加工食品提供理論支撐。