邸松，戴鸝瑩，鐘方麗，王曉林

吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院（吉林 132022）

刺玫果（Rosa davuricaPall.）系薔薇科薔薇屬植物山刺玫成熟果實(shí)，廣泛分布在黑龍江、吉林、遼寧等地[1]，富含黃酮、多糖、鞣質(zhì)等成分，具有抗氧化、抗疲勞、保肝等作用[2]。刺五加（Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim.）Harms）含有皂苷、多糖、氨基酸等有效成分，具有較強(qiáng)的抗疲勞和增強(qiáng)免疫力的功能[3]。人參皂苷為人參（Panax ginsengC. A.MeY.）的主要活性成分[4]，有研究表明，人參皂苷能有效緩解機(jī)體疲勞[5]。三者均為東北道地食藥同源中藥材[6]。其中，人參、刺五加作為吉林省中藥材種植產(chǎn)業(yè)的重要組成部分，被廣泛種植在長(zhǎng)白山地區(qū)[7]。試驗(yàn)以東北地產(chǎn)刺玫果、人參、刺五加為原料，充分利用3種植物均具有較強(qiáng)抗疲勞功能的優(yōu)勢(shì)，經(jīng)醇提、純化得到雙刺參總皂苷，研究開(kāi)發(fā)保健功能為抗疲勞的中藥類(lèi)保健食品——雙刺參膠囊，為東北地產(chǎn)中藥材資源的充分利用提供科學(xué)依據(jù)。

隨著中國(guó)文化在世界的推廣，中醫(yī)藥逐漸受到全世界越來(lái)越多人關(guān)注[8]。但中藥復(fù)方類(lèi)制劑因?yàn)榉脛┝看?、藥物顏色較深、成劑體積較大、不方便食用等因素，影響其在臨床應(yīng)用，阻礙中藥復(fù)方制劑進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)的腳步[9]。近年來(lái)，為有效改善中藥制劑缺點(diǎn)，達(dá)到去粗取精、富集活性成分的目的，中藥提取物的純化工藝不斷發(fā)展，逐漸成熟[10]。大孔樹(shù)脂的吸附-解吸法是常見(jiàn)的純化方式[11]。大孔樹(shù)脂是一種集吸附、篩選原理于一體，不溶于酸、堿、有機(jī)溶劑的高分子聚合物吸附劑[12]，其具有較大比表面積，可對(duì)中藥復(fù)方中的活性成分進(jìn)行吸附，且吸附物質(zhì)經(jīng)溶劑洗脫較為容易，能有效對(duì)中藥復(fù)方中的有效成分進(jìn)行富集、純化[13]。

試驗(yàn)采用大孔樹(shù)脂，通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，探索雙刺參提取物中總皂苷純化的最優(yōu)工藝條件。并對(duì)雙刺參膠囊的體外抗腫瘤活性進(jìn)行考察，為其進(jìn)一步研究及開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為東北中藥種植產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供思路。

1 試劑與方法

1.1 材料與試劑

刺玫果、刺五加、人參（中藥飲片，吉林國(guó)安藥業(yè)有限公司）；大孔吸附樹(shù)脂（LSA-10、AB-8、LX-19、LX-8、LSA-21、D-101、LX-36型，西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司）；香草醛（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；無(wú)水乙醇（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；濃硫酸（天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑有限公司）；α-萘胺（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；鹽酸萘乙二胺（分析純，天津市化學(xué)試劑研究所有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴振蕩器（SHA-B型，金壇市科析儀器有限公司）；紫外分光光度計(jì)（TU-1950型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；超聲波清洗器（KQ-250DE型，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 雙刺參總皂苷溶液的配制

按處方量稱(chēng)取刺玫果粉、刺五加粉、人參粉，混合均勻后，加入5倍量90%乙醇，于80 ℃水浴提取2次，每次1 h，過(guò)濾，濾液合并，在60 ℃條件下減壓濃縮、干燥，得到雙刺參總皂苷提取物。稱(chēng)取適量總皂苷提取物，以水為溶劑經(jīng)超聲處理，即得供試品溶液。

1.4 總皂苷的含量測(cè)定

采用香草醛-乙醇-濃硫酸法[14]進(jìn)行顯色，吸取0.5 mL供試品溶液，于80 ℃水浴蒸干溶劑，加入0.5 mL 8%香草醛-乙醇溶液，加入72%濃硫酸混合均勻，于60 ℃水浴15 min，室溫放置15 min，于540 nm測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（y=23.01x+0.057 7，R2=0.999 4）計(jì)算總皂苷含量。

1.5 總皂苷的純化工藝研究

1.5.1 大孔樹(shù)脂的篩選

選用LSA-10、AB-8、LX-19、LX-8、LSA-21、D-101、LX-36型大孔樹(shù)脂，參考文獻(xiàn)[15]的方法對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行處理。稱(chēng)取2.0 g樹(shù)脂，加入30 mL總皂苷質(zhì)量濃度為2 mg/mL供試品溶液，室溫振蕩吸附2 h，靜置24 h，充分吸附后進(jìn)行抽濾，取適量濾液，于540 nm測(cè)定其吸光度，計(jì)算其對(duì)總皂苷的吸附率。樹(shù)脂中加入50 mL 80%乙醇，室溫振蕩2 h進(jìn)行解吸。解吸后吸取適量上清液，于540 nm測(cè)定其吸光度，計(jì)算其對(duì)總皂苷的解吸率，篩選出3種吸附-解吸效果較好的樹(shù)脂進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

式中：C0為原液中總皂苷的質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為吸附后溶液中總皂苷質(zhì)量濃度，mg/mL；C2為解吸液中總皂苷質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為吸附液體積，mL；V2為解吸液體積，mL。

1.5.2 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附及解吸動(dòng)力學(xué)考察

根據(jù)樹(shù)脂篩選試驗(yàn)結(jié)果，稱(chēng)取效果較好的3種樹(shù)脂，每種7份，每份2.0 g，置于100 mL錐形瓶中，分別加入30 mL總皂苷質(zhì)量濃度2 mg/mL供試品溶液，室溫下分別吸附1，2，3，4，5，6和7 h，取適量上清液，于540 nm測(cè)定其吸光度，計(jì)算其對(duì)總皂苷的吸附率，以吸附時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸附率為縱坐標(biāo)，繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

3種樹(shù)脂各取7份，每份2.0 g，置于100 mL錐形瓶中，加入30 mL總皂苷質(zhì)量濃度2 mg/mL供試品溶液，室溫振蕩吸附2 h，靜置12 h后抽濾，各加入50 mL 80%乙醇，分別解吸10，20，30，60，120，180和240min，取適量解吸液，于540 nm測(cè)定其吸光度，計(jì)算其對(duì)總皂苷的解吸率，以解吸時(shí)間為橫坐標(biāo)，解吸率為縱坐標(biāo)，繪制靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線。

1.5.3 單因素試驗(yàn)

根據(jù)樹(shù)脂選擇的結(jié)果，稱(chēng)取若干份D-101大孔樹(shù)脂（2 g/份），分別考察供試品溶液pH（pH 1，2，3，4，5，6，7，8和9）、供試品溶液總皂苷質(zhì)量濃度（1，2，3，4，5和6 mg/mL）、供試品溶液加入量（5，10，15，20，25和30倍）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（0，10%，30%，50%，70%和90%）及解吸液加入量（5，10，15，20，25和30倍）5個(gè)因素對(duì)吸附率及解吸率的影響。

1.5.4 正交試驗(yàn)法優(yōu)化總皂苷純化工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取供試品溶液加入量、供試品溶液總皂苷質(zhì)量濃度、解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)及解吸液體積4個(gè)對(duì)純化影響較大的因素，建立四因素三水平正交試驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交因素水平表

1.5.5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)及總皂苷的含量測(cè)定

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，稱(chēng)取10.0 g D-101型大孔樹(shù)脂，共3份，按照最優(yōu)工藝進(jìn)行純化試驗(yàn)，計(jì)算吸附率、解吸率及δRSD。合并3次工藝驗(yàn)證性試驗(yàn)的解吸液，于60 ℃濃縮至稠膏狀，減壓干燥，得到總皂苷純化物。取1.0 g純化物，加入30 mL甲醇，超聲處理30 min后過(guò)濾，濾渣經(jīng)甲醇洗滌2次，合并濾液及洗滌液，定容至50 mL。吸取適量上液，按顯色方法進(jìn)行顯色、測(cè)定吸光度，計(jì)算干浸膏中總皂苷的含量。

式中：C為溶液中總皂苷濃度，mg/mL；M為純化物質(zhì)量，g。

1.6 雙刺參總皂苷的體外抗腫瘤活性研究

1.6.1 清除亞硝酸鹽活性

在15 mL模擬胃液（pH 3.0）中加入2 mL雙刺參總皂苷供試品溶液，混合，加入2.5 mL 10 μg/mL亞硝酸鈉溶液，于37 ℃恒溫水浴反應(yīng)30 min，取出后立即加入0.5 mL 0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置15 min后加入0.25 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液及7 mL蒸餾水，混合均勻，放置15 min[16]。于538 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度Ai；取2 mL供試品溶液，其余各液由60%乙醇替代同法操作測(cè)定Aj；以60%乙醇替代供試品溶液，同法操作測(cè)得A0，按式（4）計(jì)算清除率。

1.6.2 阻斷亞硝胺合成的活性

參考文獻(xiàn)[17]的方法。取2.0 mL pH 3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，加入2.0 mmol/L亞硝酸鈉溶液、2.0 mmol/L二甲胺溶液各0.6 mL、各供試品溶液1.0 mL，混合均勻，加入1.5 mL蒸餾水，于37 ℃水浴恒溫反應(yīng)1 h，用移液管吸取1.0 mL溶液，加到直徑7 cm的培養(yǎng)皿中，加入0.5 mL 0.5%碳酸鈉溶液，在254 nm紫外燈下照射15 min，取出，分別加入1.5 mL 1%對(duì)氨基苯磺酸溶液、0.5 mL 0.1%α-萘胺溶液和0.5 mL蒸餾水，搖勻，放置15 min，用紫外分光光度計(jì)在525 nm處分別測(cè)定吸光度AX；以60%乙醇替代供試品溶液同上操作測(cè)定A0，按式（5）計(jì)算清除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素考察結(jié)果

2.1.1 大孔樹(shù)脂的篩選

通過(guò)對(duì)7種大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附率及解吸率的測(cè)定，繪制出圖1。LSA-10、AB-8及D-101這3種大孔樹(shù)脂的吸附率與解吸率均較高，可有效對(duì)雙刺參總皂苷進(jìn)行富集純化，所以選擇3種樹(shù)脂進(jìn)行吸附動(dòng)力學(xué)及解吸動(dòng)力學(xué)考察。

圖1 大孔樹(shù)脂對(duì)皂苷吸附率及解吸率比較

2.1.2 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附及解吸動(dòng)力學(xué)曲線的繪制

通過(guò)對(duì)不同吸附時(shí)間及解吸時(shí)間下，大孔樹(shù)脂對(duì)總皂苷吸附率與解吸率的測(cè)定，分別繪制大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線（圖2）和大孔樹(shù)脂靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線（圖3）。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，以吸附率與解吸率的乘積作為純化能力考察指標(biāo)，3種樹(shù)脂中D-101型與LSA-10型2種大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附4 h后，吸附率基本不變，且兩者吸附率相當(dāng)，AB-8型大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附3 h后，吸附率基本不變，但其吸附率小于D-101型和LSA-10型大孔樹(shù)脂。D-101、AB-8型大孔樹(shù)脂靜態(tài)解吸30 min后，解吸率達(dá)到最高，而LSA-10型大孔樹(shù)脂需要解吸1 h后，解吸率基本不變。通過(guò)比較解吸率，D-101型大孔樹(shù)脂的解吸率95%以上，相比較于其他2種樹(shù)脂，解吸效果較好。以吸附率與解吸率的乘積為考察指標(biāo)，3種樹(shù)脂的純化能力由強(qiáng)到弱的順序?yàn)镈-101＞LSA-10＞AB-8，其吸附時(shí)間4 h，解吸時(shí)間30 min。故選擇D-101進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)考察

圖3 大孔樹(shù)脂靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)考察

2.1.3 pH對(duì)吸附率的影響

從圖4中可以看出，溶液pH 1～4時(shí)，樹(shù)脂對(duì)雙刺參總皂苷的吸附率變化不大，pH＞4時(shí)，大孔樹(shù)脂對(duì)總皂苷的吸附率逐漸下降。經(jīng)過(guò)測(cè)定，雙刺參總皂苷溶液的pH 4.0±0.2，所以無(wú)需對(duì)供試品溶液的pH進(jìn)行調(diào)節(jié)。

2.1.4 供試品溶液中總皂苷質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響

通過(guò)大孔樹(shù)脂對(duì)總皂苷質(zhì)量濃度不同的供試品溶液的吸附率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，隨總皂苷質(zhì)量濃度增加而下降，總皂苷質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，吸附率最大。分析其原因，總皂苷質(zhì)量濃度低，有利大孔樹(shù)脂對(duì)有效成分富集，質(zhì)量濃度升高后，其富集能力下降，但總皂苷質(zhì)量濃度過(guò)低，生產(chǎn)效率低下。故選擇質(zhì)量濃度1 mg/mL進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖4 pH對(duì)大孔樹(shù)脂吸附率的影響

圖5 總皂苷溶液質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響

2.1.5 供試品溶液加入量對(duì)吸附率的影響

由圖6可以看出，大孔樹(shù)脂對(duì)總皂苷的吸附效果，隨供試品溶液用量增加而逐漸減弱。料液比為1∶5（g/mL）時(shí)，吸附率最高，為78.23%，料液比為1∶10（g/mL）時(shí)，雖然略有下降，但變化不大，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，后續(xù)試驗(yàn)選擇料液比1∶10（g/mL）進(jìn)行。

圖6 總皂苷溶液用量對(duì)吸附率的影響

2.1.6 解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響

根據(jù)試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果，以乙醇體積分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，解吸率為縱坐標(biāo)繪制圖7。乙醇體積分?jǐn)?shù)0～70%，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)遞增，總皂苷解吸率逐漸增加。乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)70%后，繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，解吸率變化不大，故選擇70%乙醇進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響

2.1.7 解吸液加入量對(duì)解吸率的影響

根據(jù)圖8可以看出，總皂苷的解吸率隨著解吸液加入量增加而增加，解吸液加入量大于25倍時(shí)，解吸率雖然有所增加，但整體變化不大。

圖8 解吸液加入量對(duì)解吸率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表2分析可知，4種因素對(duì)總皂苷純化的影響較大的乙醇體積分?jǐn)?shù)（C），其次為供試品溶液加入量（A），供試品溶液總皂苷質(zhì)量濃度（B）與解吸液加入量（D）影響程度相當(dāng)，最優(yōu)工藝條件為A1C3B1D1，即加入7倍量總皂苷質(zhì)量濃度1 mg/mL供試品溶液，室溫振蕩吸附4 h后抽濾，加入22倍量75%乙醇，室溫解吸30 min。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析表

2.3 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)及總皂苷含量測(cè)定的結(jié)果

稱(chēng)取10.0 g D-101型大孔樹(shù)脂，共3份，置于250 mL錐形瓶中，分別加入7倍量，總皂苷質(zhì)量濃度1 mg/mL的供試品溶液，室溫下振蕩吸附4 h，抽濾，測(cè)定吸附率。向容器中加入22倍量75%乙醇，室溫振蕩解吸30 min，取適量上清液，測(cè)定解吸率。結(jié)果表明，3次試驗(yàn)的吸附率分別為83.01%，83.51%和82.84%，平均吸附率為83.12%，δRSD為0.42%；解吸率分別為98.60%，99.27%和98.80%；平均解吸率為98.89%，其δRSD為0.35%，說(shuō)明該工藝穩(wěn)定、純化總皂苷的效率高，可用于雙刺參總皂苷的純化。

經(jīng)過(guò)測(cè)定，干浸膏中總皂苷的含量由純化前的17.83%提高到37.04%，提高2.08倍。結(jié)果表明D-101型大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附-解吸法能有效純化雙刺參總皂苷。

2.4 體外抗腫瘤活性的測(cè)定結(jié)果

從圖9和圖10可以看出，雙刺參提取物清除亞硝酸鹽活性、阻斷亞硝胺合成活性與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)趨勢(shì)。通過(guò)對(duì)供試品溶液質(zhì)量濃度及其清除率的擬合，分別得到清除亞硝酸鹽活性的擬合方程為y=11.636x-43.526（R2=0.970 5），阻斷亞硝胺活性的擬合方程為y=1.622 6x+36.937（R2=0.969 9）。經(jīng)過(guò)計(jì)算，雙刺參提取物清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成活性的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度分別為0.56 mg/mL和8.05 μg/mL，表明雙刺參膠囊具有一定體外抗腫瘤活性。

圖9 總皂苷清除亞硝酸鹽活性

圖10 總皂苷阻斷亞硝胺合成活性

3 結(jié)論

通過(guò)靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)、靜態(tài)吸附及解吸動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)，考察7種大孔樹(shù)脂對(duì)雙刺參總皂苷的純化效果，采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，對(duì)D-101型大孔樹(shù)脂純化雙刺參總皂苷的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，D-101型大孔樹(shù)脂對(duì)雙刺參總皂苷具有較好的純化效果，最優(yōu)純化工藝為D-101型大孔樹(shù)脂中加入7倍量，總皂苷質(zhì)量濃度1 mg/mL供試液，室溫振蕩吸附4 h，以22倍量75%乙醇振蕩解吸30 min。在此工藝條件下，雙刺參總皂苷的吸附率為83.12%，解吸率為98.80%，純化后干浸膏中的總皂苷含量由17.83%提高到37.04%。

體外抗腫瘤活性試驗(yàn)中，雙刺參提取物清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺活性的IC50值分別為0.56 mg/mL和8.05 μg/mL，表明雙刺參提取物具有一定體外抗腫瘤活性。試驗(yàn)結(jié)果為雙刺參膠囊的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)奠定數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。