吳上,楊陽,孫嘉笛,楊嘉,張銀志,孫秀蘭*,紀劍*

消毒劑脅迫鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028s的抗性及耐藥性測定

吳上1,楊陽1,孫嘉笛1,楊嘉2,張銀志1,孫秀蘭1*,紀劍1*

1. 江南大學 食品學院, 江蘇 無錫 214122 2. 揚州市食品藥品檢驗檢測中心, 江蘇 揚州 225000

為探索消毒劑脅迫后的鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028s的抗性及對抗生素的耐藥性，本研究選取次氯酸鈉、氯已定（97%）、苯扎氯銨（80%）和十六烷基氯化吡啶（≥98%）分別脅迫鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028s，脅迫后菌株經消毒劑抗性測定及抗生素耐藥性測定。結果表明，脅迫后的沙門氏菌，對4種消毒劑的抗性幾乎不變，而對部分抗生素的抗性產生顯著變化，其中經氯已定、次氯酸鈉脅迫的菌株對環(huán)丙沙星和氨芐西林的耐藥性顯著增強，對慶大霉素的耐藥性減弱；苯扎氯銨、十六烷基氯化吡啶脅迫的菌株對環(huán)丙沙星、四環(huán)素和慶大霉素的耐藥性提升。因此，消毒劑的過度使用，對食品加工中耐藥菌的防控具有理論意義。

沙門氏菌; 消毒劑; 抗性; 耐藥性

在過去的幾十年中，抗生素的治療性誤用和過度使用導致細菌對抗生素的耐藥性急劇增加[1]。感染耐藥沙門氏菌導致發(fā)病率和死亡率增加[2]。預防和控制家畜感染沙門氏菌依賴于在飼料中添加抗生素。然而，在不同的國家已經報道了許多抗抗生素的細菌[3-5]。大多數(shù)耐藥沙門氏菌是人畜共患病的，沙門氏菌在畜禽動物宿主中獲得耐藥性，并可能通過食物鏈引起人類感染。根據(jù)疾病控制和預防中心（CDC）公布的數(shù)據(jù)，在美國，每年約有6200例感染耐藥性沙門氏菌（占沙門氏菌感染總數(shù)的10%）[2]。鼠傷寒沙門氏菌血清型是產生抗生素耐藥性的主要血清型之一，也是引起多重耐藥性的沙門氏菌感染的主要菌株之一[6]。鼠傷寒沙門氏菌耐藥性的增加導致抗生素的療效下降是構成治療失敗的主要原因，對公眾健康構成嚴重威脅[7]。

消毒劑廣泛用于控制食品生產設施和環(huán)境中的微生物污染[8]。在目前可用的各種消毒劑中，含氯消毒劑（Chlorine-Containing Disinfectant）如次氯酸鈉（Sodium Hypochlorite，SH）和氯已定（Chlorhexidine，CH）；季銨化合物（Quaternary Ammonium Compounds，QACs）如苯扎氯銨（Benzalkonium Chloride，BC）和十六烷基氯化吡啶（CetylpyridiniumChloride，CTPC）被廣泛使用，因為這些化合物無刺激性和腐蝕性，毒性小，抗菌效率高[9]。在食品環(huán)境中廣泛使用和濫用QACs消毒劑可對細菌施加選擇性壓力，并有助于抗消毒劑微生物的出現(xiàn)。

消毒劑抗性基因通常位于移動遺傳元件中[10,11]。消毒劑的廣泛使用引起了人們對其可能參與抗菌素耐藥性的發(fā)展，特別是對抗生素的共同耐藥性的關注[10,12]。因此，在同時使用抗生素和消毒劑的壓力下，抗性基因的潛在共選擇和獲得性抗性的傳播得以增強[13,14]。然而，關于消毒劑環(huán)境脅迫下沙門氏菌對消毒劑和抗生素的抗性變化規(guī)律知之甚少。本實驗測定了鼠傷寒沙門氏菌標準菌株ATCC 14028s對消毒劑MIC值，并制備了消毒劑脅迫菌株，隨后對脅迫后菌株的消毒劑及抗生素抗性進行檢測，探討了兩種抗性之間的關系，推測了耐藥變化的原因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源14028s菌株由華中農業(yè)大學（中國湖北）提供。該菌株在-80 ℃下儲存在20％甘油中。通過將100 μL轉移至5 mL營養(yǎng)肉湯（NB）中，然后在37 °C下孵育24 h來制備培養(yǎng)物。

1.1.2 主要儀器與試劑 THZ-D臺式恒溫振蕩器（太倉市強樂實驗設備有限公司），WGZ-XT細菌濁度儀（杭州齊威儀器有限公司），KJ-201C微量振蕩儀（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）。選用4種常見消毒劑次氯酸鈉、氯已定（97%）、苯扎氯銨（80%）和十六烷基氯化吡啶（≥98%）（阿拉丁試劑上海有限公司）進行消毒劑抗性測定及脅迫菌株制備。鼠傷寒沙門氏菌標準菌株ATCC14028s受到14種抗生素的挑戰(zhàn)，14種抗生素包括：抑制細胞壁合成的藥物包括氨芐西林（98%）、美羅培南（≥98%）、頭孢他啶（97%）、頭孢噻肟（≥98%）和粘菌素（98%）（中國麥克林生化有限公司）；抑制蛋白質合成的藥物包括阿奇霉素98%、鏈霉素99%、丁胺卡那霉素98%、替加環(huán)素98%（中國麥克林生化有限公司）、四環(huán)素98%和氯霉素98%（中國子起生物有限公司）；抑制核酸合成的藥物包括甲氧芐啶99.13%（中國子起生物有限公司）、萘啶酸98%（中國阿拉丁公司）、磺胺甲惡唑和環(huán)丙沙星≥99%（中國麥克林生化有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 ATCC 14028s對四種消毒劑的抗性測定采用二倍稀釋法用已滅菌的無菌水稀釋消毒劑，首先配置10240 μg/mL的最高濃度消毒劑，隨后從最高濃度消毒劑中吸取1 mL消毒劑溶液到9 mL無菌水中，將稀釋液加入96孔板第一孔中，梯度稀釋使其濃度從1024、512、256 μg/mL依次遞減到0.125 μg/mL，每個梯度3個重復。過夜培養(yǎng)的鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028s新鮮菌液經過校準的濁度儀調整菌液濁度至0.5麥氏單位濁度，取上述菌懸液50 μL至含有10 mL MH培養(yǎng)基的無菌加樣槽中，充分混勻后按照100 μL/孔加至含梯度稀釋消毒劑的96孔板中，每個孔中液體的最終體積為200 μL。置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內37℃孵育18~22 h，肉眼觀察讀取結果，結果解釋參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）藥敏試驗解釋標準，以大腸桿菌（ATCC 25922）菌株為質控菌株。

1.2.2 消毒劑脅迫后ATCC 14028s菌株的制備 參考沙門氏菌對四種消毒劑的最小抑制濃度（MIC）測定結果，將200 μL過夜培養(yǎng)的鼠傷寒沙門氏菌懸浮液分別加入到含有0.5MIC濃度的氯已定（CH）、次氯酸鈉（SH）、苯扎氯銨（BC）、氯化十六烷基吡啶（CTPC）的20 mL培養(yǎng)基，在37 ℃、200 rpm的條件下培養(yǎng)8 h，制得四種消毒劑的應激培養(yǎng)物。對培養(yǎng)物進行稀釋，以在抗生素激發(fā)的反應混合物中產生約6 log10 CFU/mL的最終濃度，每個消毒劑脅迫培養(yǎng)物設置三組生物學平行。（接種環(huán)浸泡在應激培養(yǎng)物中，然后通過劃線接種到MH固體培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)物在37 ℃下保持16~18 h。將MH固體培養(yǎng)基中的單個菌落浸入5 mL MH液體培養(yǎng)基中，并在以下條件下在搖床中培養(yǎng)：37 ℃，220 rpm，5 h。）

1.2.3 細菌存活率測試 參考GB 4789.2-2016菌落總數(shù)測定方法，對四種消毒劑的應激培養(yǎng)物和空白對照培養(yǎng)物進行菌落計數(shù)，使用營養(yǎng)瓊脂平板確定每種細胞懸液中的活菌數(shù)量，培養(yǎng)、觀察并計算。

1.2.4 消毒劑脅迫后菌株消毒劑抗性測定重復1.2.1中所述方法，挑取提前制備好的消毒劑脅迫菌株的新鮮菌落進行消毒劑抗性測定。

1.2.5 微量肉湯稀釋法藥敏測試 MIC是指抑制受試微生物可見生長所需的最低抗生素濃度，通過肉湯微量稀釋法測定。在無菌96孔板的第一孔中加入200 μL的1024 μg/mL抗菌溶液，然后用無菌水以兩倍的梯度稀釋至0.015 μg/mL，每個梯度3個重復；在配置好的不同抗生素濃度梯度的96孔板中每孔加入100 μL待測細菌溶液；在3個空孔中加入200 μL液體培養(yǎng)基作為空白。將消毒劑脅迫后菌株的新鮮菌液稀釋至最終濃度約為6 log10 CFU/mL，用于抗生素藥敏測試。取上述菌懸液按照100 μL/孔加至配置好的藥敏板中，每個孔中液體的最終體積為200 μL。置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內37 ℃孵育18~22 h，肉眼觀察讀取結果（結果解釋參照CLSI藥敏試驗解釋標準），以大腸桿菌（ATCC 25922）菌株為質控菌株。

1.2.6 結果注釋使用CLSI標準推薦的參考值（見表1）測定受試抗生素對鼠傷寒沙門氏菌的MIC折點值。

注：由美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）提出。MIC: 最小抑制濃度(Minimal Inhibitory Concentration) 抑制微生物可見生長所需的最低抗生素濃度。

Note: As proposed by the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) in America. Mic: ( Minimal Inhibitory Concentration ) the lowest concentration of the antibiotics required to inhibit the visible growth of the microorganism.

1.2.7 統(tǒng)計分析所得數(shù)據(jù)用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 ATCC 14028s對四種消毒劑的MIC值

鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028s對CH、SH、BC和CTPC的MIC分別為4、2、16、16 μg/mL（見表2）。ATCC對季銨化合物的抗性高于對含氯消毒劑的抗性。有報道，腸桿菌對BC的MIC < 30 μg/mL為敏感，MIC于30~50 μg/mL為低水平耐藥，MIC > 50 μg/mL為高水平耐藥[15]。說明標準菌株14028s對四種消毒劑均敏感。隨后用0.5倍MIC濃度的四種消毒劑（即2 μg/mL的CH；1 μg/mL的SH；8 μg/mL的BC；8 μg/mL的CTPC）分別脅迫ATCC菌株。

表 2 ATCC14028s對消毒劑的MIC值

2.2 細菌存活率

四種消毒劑脅迫菌株的活菌量均有不同程度的減少（見圖1）。經0.5 MIC濃度（2 μg/mL）的氯已定脅迫后，ATCC 14028s的活菌量減少為原來的0.34倍（<0.0001）；經1 μg/mL的次氯酸鈉脅迫后，ATCC 14028s的活菌量減少為原來的0.52倍（<0.005）；經8 μg/mL的苯扎氯銨脅迫后，ATCC 14028s的活菌量減少為原來的0.35倍（<0.0001）；經8 μg/mL的氯化十六烷基吡啶后，ATCC 14028s的活菌量無顯著性變化（＞0.05）。采用單因素顯著性分析（t-test）計算四組脅迫菌株分別與對照組之間的差異顯著性。

圖 1 消毒劑脅迫后ATCC14028s的活菌量

注：****表示<0.0001，有顯著性差異；***表示<0.005，有顯著性差異；ns表示＞0.05，無顯著性差異。

Note: ****,<0.0001, with significant difference; ***,<0.005, with significant difference; ns,＞0.05, without significant difference.

2.3 消毒劑脅迫后ATCC 14028s對消毒劑的抗性變化

經0.5 MIC濃度（2 μg/mL）的氯已定脅迫8 h后，菌株對CH的抗性增強2倍（見表3），對其他三種消毒劑的抗性未發(fā)生變化，MIC由4 μg/mL增加到8 μg/mL。經0.5 MIC濃度（8 μg/mL）苯扎氯銨刺激后，菌株對CH的MIC值由4 μg/mL增加到8 μg/mL，抗性也增強了2倍。而0.5 MIC濃度的SH和CTPC刺激并未改變四種消毒劑的抗性。消毒劑脅迫后ATCC 14028s的抗性變化微弱且只有氯已定抗性在CH和BC脅迫后微弱增強。

表 3 ATCC14028s經消毒劑脅迫后對四種消毒劑的抗性變化

2.4 消毒劑脅迫后ATCC 14028s對14種抗生素耐藥變化

經CH、SH脅迫后，ATCC 14028s對環(huán)丙沙星的MIC值由0.015 μg/mL增加至0.06 μg/mL，耐藥性增加4倍（見表4）；對氨芐西林的耐藥性增加2倍，MIC值由2 μg/mL變?yōu)? μg/mL；對慶大霉素的耐藥性減弱2倍，MIC值由32 μg/mL變?yōu)?6 μg/mL（＜0.05）。經BC、CTPC脅迫后，ATCC 14028s對環(huán)丙沙星的MIC值由0.015 μg/mL增加至0.06 μg/mL，耐藥性增加4倍；對四環(huán)素的耐藥性MIC值由2 μg/mL增加至8 μg/mL，耐藥性增加4倍；對慶大霉素的耐藥性增強4倍，MIC值由32 μg/mL增加至128 μg/mL（＜0.05）。ATCC 14028s經消毒劑脅迫后對鏈霉素、甲氧芐啶等10種抗生素的耐藥性無變化（＞0.05）。

表 4 ATCC14028s經消毒劑脅迫后14種抗生素的耐藥性變化

注：+，MIC值增加了0.5到2倍（＜0.05）；++，MIC值增加了2到4倍（＜0.05）；-，MIC值減少了0.5到2倍（＜0.05）；0，MIC值未發(fā)生變化（＞0.05）。S代表敏感；R代表耐藥。

Note: +, 0.5- to 2-fold increase in MIC (0.05). ++, 2.1- to 4-fold increase in MIC (0.05). -,0.5- to 2-fold decrease in MIC (0.05). 0, no change (> 0.05). S: Susceptible; R: Resistant.

3 討論

消毒劑脅迫后菌株的活菌量均有不同程度的減少，這種亞致死脅迫會迫使細菌產生應激反應，進而提高對某些環(huán)境或抗菌劑的抗性。本研究表明被檢測的鼠傷寒沙門氏菌菌株最初對所檢測的消毒劑敏感，四種消毒劑脅迫對沙門氏菌消毒劑抗性幾乎無影響，只有氯已定的抗性在CH和BC脅迫后略微增強。據(jù)報道，細菌長期暴露于消毒劑環(huán)境中培養(yǎng)、傳代將會提高菌體對消毒劑的抗性[16]。而本研究中使用的消毒劑的短期脅迫則不會改變沙門氏菌對消毒劑的抗性。

在目前的研究中，被檢測的鼠傷寒沙門氏菌菌株最初對所檢測的抗生素敏感，但當ATCC暴露在四種消毒劑脅迫下時，它對環(huán)丙沙星抗生素耐藥性增加。其中兩種含氯類消毒劑CH和SH均使環(huán)丙沙星和氨芐西林的耐藥性增強，慶大霉素耐藥性減弱。兩種季銨鹽類消毒劑也引起了相同的抗生素耐藥性變化，BC和CTPC均使環(huán)丙沙星、四環(huán)素和慶大霉素耐藥性提高。如果這代表了一個更廣泛的現(xiàn)象，它可能部分解釋了食品加工中消毒劑的廣泛使用導致了沙門氏菌耐藥性的出現(xiàn)。沙門氏菌暴露于同一類別消毒劑環(huán)境中，引起的抗生素耐藥變化相同。季銨鹽類消毒劑與含氯消毒劑對抗生素耐藥性的影響存在差異，推測不同種類的消毒劑作用誘發(fā)了不同的耐藥機制?？股氐臑E用和廣泛使用導致抗生素抗性的獲得，消毒劑的使用也同樣會造成抗生素耐藥的出現(xiàn)[1]。

QACs類消毒劑會引起的外排泵過表達，這可能會導致多藥外排泵與氟喹諾酮類藥物產生交叉耐藥性；細菌經QACs脅迫后產生的應激反應可能會促進喹諾酮抗性確定區(qū)域中的突變[12]，從而提高了對喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星的耐藥性。環(huán)丙沙星作為喹諾酮類藥物以細菌的脫氧核糖核酸（DNA）為靶，妨礙DNA回旋酶，進一步造成細菌DNA的不可逆損害。含氯消毒劑的氯化作用對DNA造成了輕微的損傷，增加氯濃度導致更多的DNA和mRNA損傷[17]，推測含氯消毒劑脅迫會損壞沙門氏菌中環(huán)丙沙星的DNA作用靶點，提高了對環(huán)丙沙星的耐藥性。

本研究中觀察到的其他抗生素耐藥性變化可能與以下一種或多種機制有關:細胞壁抗生素結合位點的減少，負責外流泵合成和運行的基因的擴增，以及應激休克蛋白的誘導。細菌可以通過下調細胞壁中的青霉素結合蛋白（如PBPs等）來應對不同消毒劑的不利環(huán)境挑戰(zhàn)，這可能是氨芐西林耐藥性提高的原因。細菌可以通過增強外排泵（如四環(huán)素外排蛋白TetA）外排作用降低抗生素細胞質濃度的能力，這是引起四環(huán)素耐藥性增加的重要機制。并且可以通過合成伴侶蛋白來維持細菌的存活應激或抗生素挑戰(zhàn)期間的蛋白質功能[18]。

4 結論

沙門氏菌經消毒劑脅迫會產生應激反應，這種對消毒劑的適應性反應導致對其他應激的抵抗力-抗生素抵抗力發(fā)生變化，而對四種消毒劑的抗性幾乎不變。含氯消毒劑脅迫菌株對環(huán)丙沙星和氨芐西林的耐藥性顯著增，對慶大霉素的耐藥性減弱；季銨鹽消毒劑脅迫菌株對環(huán)丙沙星、四環(huán)素和慶大霉素的耐藥性提升。消毒劑可以與抗生素產生共同耐藥，誘發(fā)對消毒劑耐藥及抗生素耐藥的“雙耐藥菌株”的產生。本研究為食品加工中消毒劑的規(guī)范性使用提供指導，為深入研究消毒劑誘發(fā)的耐藥性產生機制和進一步改進工業(yè)界干預措施和風險管理提供了有價值的信息。

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The Resistance and Drug Resistance ofTyphimurium ATCC 14028s by Disinfectants Stress

WU Shang1, YANG Yang1, SUN Jia-di1, YANG Jia2, ZHANG Yin-zhi1, SUN Xiu-lan1*, JI Jian1*

1.214122,2.225000,

To explore the disinfectant after the stress ofTyphimurium ATCC14028s resistance and resistance to antibiotics, this study selected Sodium Hypochlorite, Chlorhexidine (97%), Benzalkonium Chloride (80%) and Cetyl Pyridine Chloride (98% or higher) respectively stress ofTyphimurium ATCC14028s, stress strain after the determination of disinfectant resistance and antibiotic resistance. The results showed that the resistance ofto four kinds of disinfectants was almost unchanged after stress, but the resistance to some antibiotics changed significantly. The resistance ofstrains to Ciprofloxacin and Ampicillin increased significantly after stress of Chlorhexidine and Sodium Hypochlorite, and the resistance to Gentamicin decreased. The resistance to Ciprofloxacin, Tetracycline and Gentamicin of strains stressed by Benzalkonium Chloride and Cetylpyridine Chloride was increased. Therefore, the overuse of disinfectants has theoretical significance for the prevention and control of drug-resistant bacteria in food processing.

; disinfectant; resistance; drug resistance

R378.2+2

A

1000-2324(2021)01-0013-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2021.01.003

2020-04-12

2020-07-21

“十三五”國家重點研發(fā)計劃(2017YFC1600102);2020年度江蘇省市場監(jiān)督管理局科技計劃項目(KJ204139)

吳上(1996-),男,在讀碩士,專業(yè)方向:食品安全與質量控制. E-mail:744589782@qq.com

Author for correspondence. E-mail:sxlzzz@jiangnan.edu.cn; jijian@jiangnan.edu.cn