王興強(qiáng), 鄭年昊, 崔春輝, 曹 梅, 沈 曄, 劉 瑩, 張子文, 湯子威, 秦傳新, 陳百堯

金烏賊熱休克蛋白基因的挖掘及對(duì)低鹽脅迫的響應(yīng)

王興強(qiáng)1, 鄭年昊1, 崔春輝1, 曹 梅1, 沈 曄1, 劉 瑩1, 張子文1, 湯子威1, 秦傳新2, 陳百堯3

(1. 江蘇海洋大學(xué) 海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院, 江蘇 連云港 222005; 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所, 廣東 廣州 510300; 3. 連云港市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 江蘇 連云港 222005)

熱休克蛋白(heat shock proteins: HSPs)為動(dòng)植物響應(yīng)外界脅迫產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì), 能有效改善機(jī)體對(duì)外界脅迫的適應(yīng)能力。本研究基于先前獲得的低鹽脅迫金烏賊()高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 對(duì)與低鹽脅迫密切相關(guān)的熱休克蛋白(熱休克蛋白家族和晶體蛋白(crystallin)家族)基因進(jìn)行挖掘; 鑒于實(shí)時(shí)定量?jī)?nèi)參基因篩選, 同時(shí)挖掘出金烏賊肌動(dòng)蛋白(actin)家族系列基因; 然后, 對(duì)肌動(dòng)蛋白、熱休克蛋白和晶體蛋白家族基因及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析并探究低鹽脅迫對(duì)金烏賊熱休克蛋白和晶體蛋白家族基因表達(dá)的影響。金烏賊肌動(dòng)蛋白家族基因包括、內(nèi)收肌、胞質(zhì)、、和6個(gè)成員, 熱休克蛋白家族基因包括、小、、、、、、、、和11個(gè)成員, 金烏賊晶體蛋白家族基因包括、、和4個(gè)成員。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), 肌動(dòng)蛋白家族6個(gè)基因共享甘氨酸、精氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸等13個(gè)位點(diǎn), 晶體蛋白家族4個(gè)基因共享苯丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸、酪氨酸、絲氨酸和半胱氨酸等17個(gè)位點(diǎn), 而熱休克蛋白家族、小、、和5個(gè)基因共享1個(gè)甘氨酸位點(diǎn)和4個(gè)保守位點(diǎn),、、、、和6個(gè)基因僅共享2個(gè)保守位點(diǎn)。實(shí)時(shí)定量結(jié)果發(fā)現(xiàn), 低鹽脅迫可以明顯提高金烏賊、、和的基因表達(dá), 而明顯降低晶體蛋白家族基因的表達(dá), 表明在低鹽脅迫條件下, 金烏賊熱休克蛋白家族基因通過自身的差異表達(dá)來提高機(jī)體對(duì)外界脅迫的適應(yīng)防御能力。

金烏賊(); 低鹽脅迫; 肌動(dòng)蛋白; 熱休克蛋白; 晶體蛋白

發(fā)掘水生動(dòng)物的優(yōu)質(zhì)功能基因是分子生物學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn), 探究功能基因的表達(dá)模式是分子生物學(xué)的重要研究方向。熱休克蛋白(heat shock proteins: HSPs)廣泛存在于動(dòng)植物及微生物間, 為受外界高溫缺氧脅迫、化學(xué)刺激或紫外線污染等所產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì), 能夠阻止變性的蛋白聚集、協(xié)助變性的蛋白重新折疊或者溶解聚集的變性蛋白, 有效提高機(jī)體對(duì)外界脅迫的適應(yīng)防御能力; 學(xué)者們先后克隆了合浦珠母貝()、企鵝珍珠貝()、香港巨牡蠣()、太平洋牡蠣()、虹鱒()、大菱鲆()、羅氏沼蝦()和脊尾白蝦()等水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的熱休克蛋白基因[1-10]。根據(jù)熱休克蛋白基因高度保守且易受外界脅迫大量表達(dá)的特性, 可當(dāng)作生物標(biāo)記物用于環(huán)境監(jiān)測(cè)。頭足類和脊椎動(dòng)物眼睛外觀上非常相似, 均具有晶狀體細(xì)胞, 可將普遍功能的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為晶體結(jié)構(gòu)性蛋白即晶體蛋白(crystallin)并主要富集于眼睛晶狀體中; 晶體蛋白和小熱休克蛋白(small heat shock proteins: sHSPs)約有90~100個(gè)氨基酸殘基同源, 一般也歸類為熱休克蛋白家族基因成員[11-13]?；虮磉_(dá)研究需要一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的管家基因作為內(nèi)參, 肌動(dòng)蛋白(actin)是符合要求的優(yōu)質(zhì)管家基因, 不同物種間高度保守且在不同組織細(xì)胞中表達(dá)量較高, 常作為功能基因表達(dá)檢測(cè)的內(nèi)參基因; 目前已從堿蓬()、浙貝母()、鳶烏賊()和曼氏無針烏賊()等多種生物中成功克隆出肌動(dòng)蛋白基因序列, 其在不同物種間的差異不超過20%[14-18]。

金烏賊()在中國(guó)黃海中北部均有分布, 適鹽范圍28~31, 是中國(guó)重要的漁業(yè)資源; 然而自上世紀(jì)末, 環(huán)境的破壞和過度的捕撈已導(dǎo)致金烏賊資源急劇減少。在適宜鹽度范圍內(nèi), 金烏賊耗氧率和呼吸代謝酶活性保持在較低水平; 但在低鹽條件下, 金烏賊受精卵體積減少, 孵化時(shí)間延長(zhǎng), 孵化率明顯降低; 同時(shí), 金烏賊體內(nèi)釋放出大量活性氧, 如不能及時(shí)消除, 不斷積累后會(huì)破壞細(xì)胞的原始動(dòng)態(tài)平衡[19]。目前我國(guó)金烏賊人工繁育技術(shù)尚處于起步階段, 生物信息學(xué)方面的研究也較少, 金烏賊肌動(dòng)蛋白、熱休克蛋白和晶體蛋白等基因的研究尚未報(bào)道。本研究基于先前通過RNA-seq技術(shù)獲得的低鹽脅迫條件下(驟降15鹽度, 脅迫鹽度為15, 脅迫周期6 h)金烏賊高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 對(duì)與低鹽脅迫密切相關(guān)的熱休克蛋白(熱休克蛋白家族和晶體蛋白家族)基因進(jìn)行挖掘, 同時(shí)挖掘出金烏賊肌動(dòng)蛋白家族系列基因, 從分子水平探究肌動(dòng)蛋白、熱休克蛋白和晶體蛋白的進(jìn)化水平及低鹽脅迫對(duì)熱休克蛋白和晶體蛋白基因表達(dá)的影響, 以期闡明金烏賊應(yīng)答低鹽脅迫的分子調(diào)控特征, 為金烏賊分子標(biāo)記的開發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 金烏賊家族基因核苷酸序列獲取

金烏賊低鹽脅迫試驗(yàn)、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等詳細(xì)信息見文獻(xiàn)[20]。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾, 獲得高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)。利用Trinity軟件對(duì)高質(zhì)量的待分析數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭組裝, 獲得Unigene注釋文檔。為了確定金烏賊肌動(dòng)蛋白、熱休克蛋白和晶體蛋白家族基因, 搜索Unigene注釋文檔, 獲取系列基因, 通過在線序列工具包(SMS)預(yù)測(cè)開放閱讀框并翻譯成蛋白質(zhì), 通過Pfam、SMART和NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)確認(rèn)所得開放閱讀框是否正確, 如果經(jīng)過篩選后的肌動(dòng)蛋白、熱休克蛋白和晶體蛋白基因序列具有至少一個(gè)保守結(jié)構(gòu), 則確定其為金烏賊基因家族成員并選擇具有起始和終止密碼子的序列進(jìn)行對(duì)擴(kuò)驗(yàn)證, 對(duì)擴(kuò)驗(yàn)證引物見表1, 熱休克蛋白基因部分成員實(shí)時(shí)定量引物見表2。

表1 對(duì)擴(kuò)驗(yàn)證引物

注:: 內(nèi)收肌肌動(dòng)蛋白基因;: 胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白基因;: 熱休克蛋白基因;: 小熱休克蛋白基因, 下同

表2 實(shí)時(shí)定量引物

1.2 金烏賊家族基因氨基酸序列分析

金烏賊肌動(dòng)蛋白、熱休克蛋白和晶體蛋白家族基因完整編碼區(qū)分析使用Lasergene中的Editseq軟件, 氨基酸特性分析使用ProtPram, 氨基酸結(jié)構(gòu)域分析使用SMART, N糖基化位點(diǎn)分析使用NetNGlyc 1.0, 利用Clustal X多序列比對(duì), 通過Mega 7構(gòu)建進(jìn)化樹, 用自展法進(jìn)行1 000次重復(fù)檢測(cè)。

1.3 低鹽脅迫試驗(yàn)

本次試驗(yàn)材料為孵化30 d左右的烏賊自繁幼體, 體質(zhì)量1.3 g±0.3 g, 幼體苗種培育鹽度30。人工育苗所用金烏賊親體來自海州灣海域, 親體暫養(yǎng)及育苗工作均在連云區(qū)大板橋試驗(yàn)基地育苗室中完成。(1) 鹽度驟降15(脅迫鹽度為15)和10(脅迫鹽度為20)脅迫3 h后對(duì)照和低鹽脅迫組分別取5只幼體, 液氮速凍; 每個(gè)處理分別設(shè)3個(gè)重復(fù); 鹽度驟降5(脅迫鹽度為25)脅迫3、6、9、12和20 h后對(duì)照和低鹽脅迫組分別取5只幼體, 液氮速凍; 每個(gè)處理分別設(shè)3個(gè)重復(fù); (2)鹽度驟降5(脅迫鹽度為25)脅迫30、60和120 min后對(duì)照和低鹽脅迫組分別取5只幼體, 液氮速凍; 每個(gè)處理分別設(shè)4個(gè)重復(fù)。取金烏賊幼體在液氮中研磨成粉, 通過RNA提取試劑盒提取總RNA, 檢測(cè)合格后反轉(zhuǎn)錄備用。利用提取出的cDNA為模版進(jìn)行基因?qū)U(kuò), 目的條帶回收, T載連接、轉(zhuǎn)化、搖菌、涂平板和菌落PCR檢測(cè), 生工測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 金烏賊肌動(dòng)蛋白家族基因序列分析

通過與NCBI中人()、小鼠()和斑馬魚()基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), 金烏賊肌動(dòng)蛋白家族共有、內(nèi)收肌、胞質(zhì)、、和6個(gè)基因成員, 其中內(nèi)收肌、胞質(zhì)、和4個(gè)成員得到對(duì)擴(kuò)驗(yàn)證(表1, 表3)。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn), 金烏賊肌動(dòng)蛋白家族基因翻譯出氨基酸序列最短的為, 最長(zhǎng)的為。金烏賊肌動(dòng)蛋白基因家族氨基酸序列的相對(duì)分子質(zhì)量在8 913~41 438, 最低的為, 最高的為。金烏賊肌動(dòng)蛋白基因家族的理論等電點(diǎn)在9.51~9.87左右。由圖1可以看出, 6個(gè)金烏賊肌動(dòng)蛋白家族基因成員均具有actin結(jié)構(gòu)域。通過金烏賊肌動(dòng)蛋白家族基因氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), 肌動(dòng)蛋白家族6個(gè)基因成員共享5個(gè)甘氨酸(G)位點(diǎn), 2個(gè)精氨酸位點(diǎn)(R), 2個(gè)絲氨酸位點(diǎn)(S), 2個(gè)異亮氨酸位點(diǎn)(I), 1個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(T)和1個(gè)天冬氨酸位點(diǎn)(D)(圖2a)。通過Clustal X將金烏賊肌動(dòng)蛋白家族基因與其他物種的基因進(jìn)行多序列比對(duì)分析, 通過Mega 7構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3a), 發(fā)現(xiàn)金烏賊內(nèi)收肌和胞質(zhì)基因關(guān)系最近, 它們與、和基因關(guān)系較近, 獨(dú)占一個(gè)大的分支, 然后與其他物種基因聚在一起, 但以上5個(gè)成員與金烏賊基因關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.2 金烏賊熱休克蛋白家族基因序列分析

通過NCBI序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), 金烏賊熱休克蛋白家族包括、小、、、、、、、、和11個(gè)基因成員, 其中、小、、、、、和8個(gè)成員得到對(duì)擴(kuò)驗(yàn)證(表1, 表3)。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn), 金烏賊熱休克蛋白基因家族翻譯出的氨基酸序列最短的為, 最長(zhǎng)的為。金烏賊熱休克蛋白家族基因氨基酸序列的相對(duì)分子質(zhì)量在3 354~82 648, 金烏賊熱休克蛋白家族基因的理論等電點(diǎn)在5.03~10.24。由圖1可以看出, 金烏賊具有Cpn 10結(jié)構(gòu)域,、小、和均具有HSP 20結(jié)構(gòu)域,具有Cpn 60_TCP1結(jié)構(gòu)域,具有HSP 70結(jié)構(gòu)域,具有HSP 90結(jié)構(gòu)域,、和均具有HATPase_c HSP 90結(jié)構(gòu)域。通過金烏賊熱休克蛋白家族基因氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),、小、、和共享1個(gè)甘氨酸(G)位點(diǎn)和4個(gè)保守位點(diǎn), 而、、、、和僅共享2個(gè)保守位點(diǎn)(圖2b)。通過Clustal X將金烏賊熱休克蛋白家族基因與其他物種的序列進(jìn)行多重比較并通過MAGA 7軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(圖3b), 發(fā)現(xiàn)金烏賊與美洲牡蠣()、低眼無齒芒()和紅腹食人魚()基因關(guān)系較近, 與金烏賊及長(zhǎng)爪沙鼠()基因形成獨(dú)立一支; 金烏賊與三角帆蚌()、海蝸牛()、菲律賓蛤仔()、日本扇貝()和福壽螺()基因關(guān)系較近, 形成獨(dú)立一支; 金烏賊與半滑舌鰨()、虎尾海馬()和鼴鼠()基因關(guān)系較近, 形成獨(dú)立一支; 金烏賊、與真蛸()和可口革囊星蟲()基因關(guān)系較近, 形成獨(dú)立一支; 金烏賊與加州雙斑蛸()基因關(guān)系較近, 形成獨(dú)立一支, 而金烏賊與加州雙斑蛸基因關(guān)系較近, 金烏賊與水蜜桃()和李()基因關(guān)系較近, 形成獨(dú)立一支; 金烏賊與費(fèi)希爾曲霉()基因關(guān)系較近, 形成獨(dú)立一支; 金烏賊與曼氏無針烏賊和嘉庚蛸()基因關(guān)系較近。由此可見, 金烏賊熱休克蛋白家族基因與以上品種具有高度相似性。

表3 金烏賊基因家族核苷酸和氨基酸序列分析

圖1 金烏賊基因家族結(jié)構(gòu)域分析

圖2 金烏賊肌動(dòng)蛋白(a)、熱休克蛋白(b)和晶體蛋白(c)家族基因多序列比對(duì)

圖3 金烏賊肌動(dòng)蛋白(a)、熱休克蛋白(b)和晶體蛋白(c)家族基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

通過NCBI序列比對(duì), 金烏賊晶體蛋白家族基因包括、、和4個(gè)成員, 均得到對(duì)擴(kuò)驗(yàn)證(表1)。晶體蛋白家族基因(C+G)含量在45%~48%范圍內(nèi)。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn), 金烏賊晶體蛋白家族基因翻譯出的氨基酸序列最短的為, 含182個(gè)氨基酸殘基; 最長(zhǎng)的為, 含305個(gè)氨基酸殘基。金烏賊晶體蛋白家族基因氨基酸序列的相對(duì)分子質(zhì)量在21 053~35 989。金烏賊晶體蛋白家族基因的理論等電點(diǎn)在4.99~8.71。由圖1可以看出, 金烏賊、和均具有GST_N GST_C_3結(jié)構(gòu)域, 而具有PBP結(jié)構(gòu)域。通過金烏賊晶體蛋白家族基因氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),、、和4共享3個(gè)苯丙氨酸(F)位點(diǎn), 1個(gè)天冬酰胺(N)位點(diǎn), 2個(gè)甘氨酸(G)位點(diǎn), 2個(gè)天冬氨酸(D)位點(diǎn), 1個(gè)脯氨酸(P)位點(diǎn), 1個(gè)精氨酸(R)位點(diǎn), 4個(gè)酪氨酸(Y)位點(diǎn), 2個(gè)絲氨酸(S)位點(diǎn)和1個(gè)半胱氨酸(C)位點(diǎn)(圖2c)。通過Clustal X將金烏賊晶體蛋白家族基因與其他物種的序列進(jìn)行多重比較并通過MAGA 7軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(圖3c), 發(fā)現(xiàn)金烏賊與白蟻()、塵螨()、基白蟻()、西花薊馬()和海豆芽() D2蛋白及北太平洋巨型章魚()基因關(guān)系較近, 形成獨(dú)立一支; 金烏賊與玄妙微鰭烏賊()、美洲牡蠣和玄妙微鰭烏賊基因關(guān)系較近, 形成獨(dú)立一支; 金烏賊與玄妙微鰭烏賊基因關(guān)系較近, 形成獨(dú)立一支; 金烏賊與玄妙微鰭烏賊和乳光槍烏賊()基因關(guān)系較近, 形成獨(dú)立一支。由此可見, 金烏賊的蛋白crystallin家族基因與以上品種具有高度的相似性。

2.3 低鹽脅迫對(duì)金烏賊熱休克蛋白基因表達(dá)的影響

金烏賊熱休克蛋白基因表達(dá)量與鹽度的關(guān)系見表4~表6, 低鹽脅迫可以明顯提高金烏賊、、和的基因表達(dá)。在15鹽度, 低鹽脅迫3 h后顯著提高金烏賊、和的基因表達(dá)(<0.05), 而在20鹽度, 低鹽脅迫3 h后僅基因表達(dá)顯著提高(<0.05)。在25鹽度, 隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),、和基因在6 h得到顯著表達(dá)(<0.05)。低鹽脅迫明顯降低晶體蛋白家族基因的表達(dá), 由表5可以看出, 鹽度15和20脅迫可以顯著降低的基因表達(dá)(<0.05), 而在25鹽度, 隨著時(shí)間的延長(zhǎng),基因表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(<0.05)。由表6可以看出, 急性鹽度脅迫(2 h內(nèi))可以顯著降低晶體蛋白家族基因的表達(dá)量(<0.05)。

表4 低鹽脅迫對(duì)金烏賊熱休克蛋白家族基因Log2(相對(duì)基因表達(dá)量)的影響

表5 低鹽脅迫對(duì)金烏賊S crystallin基因Log2的影響

表6 低鹽脅迫對(duì)金烏賊晶體蛋白家族基因Log2的影響

3 討論

肌動(dòng)蛋白在細(xì)胞中廣泛存在, 大致分為6種; 其中α骨骼肌肌動(dòng)蛋白、α心肌肌動(dòng)蛋白、α平滑肌肌動(dòng)蛋白和γ平滑肌肌動(dòng)蛋白等4種具有肌肉組織特異性, 剩下的β肌動(dòng)蛋白和γ非肌肉肌動(dòng)蛋白2種散布于各種組織中。α肌動(dòng)蛋白是肌肉組織收縮的主要成分, β肌動(dòng)蛋白和γ肌動(dòng)蛋白在大多數(shù)細(xì)胞類型中共存, 常作為細(xì)胞骨架的組分和內(nèi)部細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的介質(zhì)[21-23]。通過金烏賊肌動(dòng)蛋白家族基因氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), 6個(gè)成員共享甘氨酸、精氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸等13個(gè)位點(diǎn)(圖2a), 表明肌動(dòng)蛋白家族基因在物種進(jìn)化上高度保守且行使相類似的功能, 不易隨著環(huán)境因子的改變或年齡的變化而發(fā)生改變, 適合在金烏賊基因表達(dá)研究中作為內(nèi)參基因。通過進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn), 金烏賊基因與內(nèi)收肌、胞質(zhì)、、和基因關(guān)系較遠(yuǎn), 具體原因推測(cè)有3: (1)基因較其他家族成員保守; (2) 內(nèi)收肌、胞質(zhì)、和4個(gè)基因成員得到對(duì)擴(kuò)驗(yàn)證, 而基因雖然進(jìn)行了對(duì)擴(kuò), 但沒有出現(xiàn)對(duì)擴(kuò)條帶, 可能與本基因拼接的精確度較低有關(guān); (3)基因堿基數(shù)1 639 bp, 較其他家族成員長(zhǎng), 可能基因內(nèi)部有重復(fù)序列, 從而影響了進(jìn)化樹的精確度。本研究挖掘出的金烏賊肌動(dòng)蛋白、熱休克蛋白和晶體蛋白家族基因經(jīng)SMART預(yù)測(cè)無明顯的信號(hào)肽與跨膜區(qū)域, 沒有信號(hào)肽的蛋白質(zhì)不太可能暴露于N糖基化機(jī)制, 所以肌動(dòng)蛋白、熱休克蛋白和晶體蛋白家族基因均無N糖基化位點(diǎn), 推測(cè)肌動(dòng)蛋白、熱休克蛋白和晶體蛋白家族蛋白在細(xì)胞質(zhì)中富集且不屬于膜蛋白, 主要在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。

當(dāng)機(jī)體在正常狀態(tài)下, 應(yīng)激反應(yīng)性熱休克蛋白主要維持機(jī)體的正常生理功能; 但當(dāng)機(jī)體受到外部環(huán)境刺激時(shí), 熱休克蛋白便開始大量誘導(dǎo)表達(dá), 提高細(xì)胞保護(hù)能力, 來抵抗外部不良環(huán)境帶來的影響, 維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[24]。根據(jù)分子質(zhì)量、序列同源性、結(jié)構(gòu)和功能, 熱休克蛋白家族基因通常被命名為、、、、和等, 本研究挖掘出熱休克蛋白和晶體蛋白兩個(gè)家族, 金烏賊熱休克蛋白家族基因包括、小、、、、、、、、和11個(gè)成員, 而晶體蛋白家族基因包括、、和4個(gè)成員。先前研究發(fā)現(xiàn), 熱休克蛋白家族部分成員具有特有的ATPase活性, 主要用于調(diào)節(jié)熱休克蛋白與蛋白質(zhì)底物的關(guān)聯(lián)和離解。當(dāng)ATP在結(jié)合狀態(tài)下時(shí), 熱休克蛋白對(duì)蛋白質(zhì)底物的親和力較低, 但當(dāng)熱休克蛋白將ATP水解成ADP時(shí), 就會(huì)與蛋白質(zhì)底物親密結(jié)合[5-6]。由圖1可以看出,、和基因均具有ATPase結(jié)構(gòu)域, 因而推測(cè)可能具有ATPase的活性。

脊椎動(dòng)物的晶體蛋白家族包含非常多樣化的可溶性蛋白質(zhì), 它們之間的結(jié)構(gòu)幾乎沒有相似之處, 譬如晶體蛋白K和晶體蛋白L/Q 存在于所有脊椎動(dòng)物物種中, 而其他類群特異性晶體蛋白則局限于特定的物種或系統(tǒng)發(fā)育群; 不過, 晶體蛋白家族基因在水生動(dòng)物中分布較窄, 且主要集中在頭足類[25-27]。先前試驗(yàn)證明, 晶體蛋白是頭足類眼部晶狀體中重要的功能蛋白, 對(duì)胞質(zhì)折射率、酶代謝和維持晶狀體結(jié)構(gòu)等方面起著重要作用[28]。本研究挖掘出金烏賊3個(gè)S型和1個(gè)O型基因。一般來說, 類群特異性晶體蛋白與代謝酶有關(guān)。蛋白GST(谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶, E.C.2.5.1.18)是一種解毒酶, 在哺乳動(dòng)物肝臟中含量較高, 通過催化某些內(nèi)源性或外來有害物質(zhì)與谷胱甘肽的結(jié)合, 從而達(dá)到解毒的目的[29-30]。由圖1可以看出, 金烏賊、和基因均具有GST結(jié)構(gòu)域; 基于物種進(jìn)化的原則, 金烏賊、和可能具有酶的活性, 以上3個(gè)基因可能來源于蛋白GST的基因復(fù)制和隨后的突變堿基替換。雖然基因不具有GST結(jié)構(gòu)域, 但氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), 晶體蛋白家族4個(gè)基因成員共享苯丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸、酪氨酸、絲氨酸和半胱氨酸等17個(gè)位點(diǎn); 相對(duì)而言, 熱休克蛋白家族、小、、和5個(gè)基因共享1個(gè)甘氨酸位點(diǎn)和4個(gè)保守位點(diǎn),、、、、和6個(gè)基因僅共享2個(gè)保守位點(diǎn), 表明在金烏賊中, 晶體蛋白家族基因較熱休克蛋白家族保守。先前, Varó[31]等通過蛋白組學(xué)方法分析攝食對(duì)章魚的影響時(shí)鑒定出43種差異表達(dá)的蛋白質(zhì), 其中包括蛋白GST、熱休克蛋白、晶體蛋白S等, 作者認(rèn)為上述蛋白質(zhì)可以作為評(píng)估與營(yíng)養(yǎng)壓力相關(guān)的生物標(biāo)志物。

本研究實(shí)時(shí)定量結(jié)果發(fā)現(xiàn), 低鹽脅迫可以明顯提高金烏賊、、和的基因表達(dá), 而明顯降低晶體蛋白家族基因的表達(dá), 表明在低鹽脅迫條件下, 金烏賊熱休克蛋白和晶體蛋白家族基因通過自身的差異表達(dá)來提高機(jī)體對(duì)外界脅迫的適應(yīng)防御能力, 因而本研究挖掘的熱休克蛋白和晶體蛋白家族基因在研究金烏賊的抗環(huán)境脅迫方面有非常重要的意義, 可為今后進(jìn)行頭足類低鹽脅迫生理機(jī)制的探討、分子標(biāo)記的開發(fā)和關(guān)鍵基因的克隆等提供參考。除了頭足類, 學(xué)者們研究發(fā)現(xiàn), 低鹽脅迫顯著影響日本大眼蟹()、虹鱒和仿刺參()等熱休克蛋白基因的表達(dá)[32-34]。相對(duì)而言, 關(guān)于低鹽脅迫對(duì)晶體蛋白家族基因表達(dá)的影響, 目前還未見相關(guān)報(bào)道。由前面討論可知, 熱休克蛋白部分成員具有ATPase結(jié)構(gòu)域, 而晶體蛋白部分成員具有GST結(jié)構(gòu)域, 推測(cè)低鹽脅迫可改變金烏賊ATP酶的活性, 降低谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的解毒能力, 有可能提高金烏賊對(duì)環(huán)境的敏感性。

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Excavation of heat shock protein gene and its response to low salinity stress in

WANG Xing-qiang1, ZHENG Nian-hao1, CUI Chun-hui1, CAO Mei1, SHEN Ye1, LIU Ying1, ZHANG Zi-wen1, TANG Zi-wei1, QIN Chuan-xin2, CHEN Bai-yao3

(1. College of Marine Science and Fisheries, Jiangsu Ocean University, Lianyungang 222005, China; 2. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fisheries Sciences, Guangzhou 510300, China; 3. Lianyungang Agricultural and Rural Bureau, Lianyungang 222005, China)

Heat shock proteins (HSPs) are a kind of proteins that are produced by plants and animals in response to external stress. Moreover, they can effectively improve the adaptability of the body toward external stress. Based on the previously obtained high-throughput transcriptome data ofunder low salinity stress, we analyzed the protein HSPs (protein HSP family and crystallin family) genes closely related to low salinity stress in this study. In view of real-time quantitative internal reference gene screening, we determined the proteinactin family genes of. Then, we analyzed the protein actins, HSPs, and crystallin family genes along with their encoded amino acid sequences via bioinformatics, and explored the effects of low salinity stress on the gene expression of protein HSPs and crystallin family of. The protein actin family genes ofhave,,,,, and. The protein HSP family genes have 11 members of,,,,,,,,,, and. The protein crystallin family gene ofhas four members:,,, and. The amino acid sequence alignment showed that the six genes of protein actin family shared 13 loci of glycine, arginine, serine, isoleucine, threonine, and aspartic acid, whereas the four genes of protein crystallin family shared 17 loci of phenylalanine, asparagine, glycine, aspartic acid, proline, arginine, tyrosine, serine, and cysteine.,,,, andshared one glycine locus and four conserved loci, whereas,,,,, andonly shared two conserved loci. The real-time quantitative results showed that under low salinity stress, the,,andgene expressions ofwere significantly increased, whereas the expression of protein crystallin family gene was significantly decreased, thereby indicating that thegene ofcould improve the adaptive defense ability to external stress via its own differential expression.

; low salinity stress; actin; heat shock protein; crystalline

May 3, 2020

Q768

A

1000-3096(2021)03-0059-12

10.11759/hykx20200503003

2020-05-03;

2020-06-03

廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助項(xiàng)目(FEEL_2019_3); 連云港市海燕計(jì)劃科研項(xiàng)目(KK19064)

[Open Fund of Guangdong Key Laboratory of Fishery Ecological Environment, No. FEEL_2019_3; Scientific Research Project of Lianyungang Haiyan Plan, No.KK19064]

王興強(qiáng)(1975—), 男, 教授, 博士, 主要從事養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)方面的研究, E-mail: wangxingqiang@jou.edu.cn

(本文編輯: 譚雪靜)