張小龍，王嘉瑞，李青卓，付彩霞，汪 超，徐 寧*

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430068；2.湖北土老憨生態(tài)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，湖北宜昌 443000）

微生物作為地球上蘊(yùn)含量巨大且最具發(fā)展?jié)摿Φ纳镔Y源，近年來隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和成本的降低，人們對(duì)微生物的分析在不斷增加。在早期的生物學(xué)研究中，研究者的目光主要集中在微生物單群體，其作為微生物群落中的關(guān)鍵功能群體將其分離、改造，以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)功能的加強(qiáng)[1]。然而人們忽視了微生物并不是單獨(dú)存在的，而是處于復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的群落中，正是它們的相互作用推動(dòng)了群落的穩(wěn)定、功能與進(jìn)化[2]。近年來，隨著食品發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用需求的不斷提高，由于功能單一的菌種在提高風(fēng)味品質(zhì)方面存在著局限性，使得利用多種功能微生物組合來構(gòu)建合成微生物群落成了發(fā)酵食品領(lǐng)域中一個(gè)研究的熱點(diǎn)。所謂的合成微生物群落是指在明確培養(yǎng)基質(zhì)的條件下，人工將兩種或兩種以上遺傳背景完全解析的微生物通過共同培養(yǎng)而形成的微生物群體，其組成可以是自然界中不一定共存的野生型菌株也可以是一個(gè)或多個(gè)經(jīng)基因改造的工程菌株[3-4]。合成微生物群落實(shí)現(xiàn)了從傳統(tǒng)單一菌種行為研究向整個(gè)微生物群落行為研究的轉(zhuǎn)變。

合成微生物群落涉及的研究領(lǐng)域眾多，其最終目標(biāo)是利用單個(gè)微生物的個(gè)體能力以及微生物間的相互作用，對(duì)復(fù)雜的代謝任務(wù)進(jìn)行勞動(dòng)分工、功能互補(bǔ)，從而實(shí)現(xiàn)特定的功能，如提高種群的生產(chǎn)力、穩(wěn)定性、代謝功能等[5]。由于合成微生物群落中的微生物是可控性的，因此可以按功能導(dǎo)向性的需求對(duì)微生物進(jìn)行組裝，使微生物彼此配合發(fā)揮更大的作用。而中國傳統(tǒng)的食品釀造是一個(gè)典型多菌種參與的復(fù)雜過程，因此若能夠構(gòu)建出穩(wěn)定高效的發(fā)酵微生物群落將對(duì)提高發(fā)酵食品質(zhì)量有著重要的意義。該文將對(duì)合成微生物群落的特征、微生物間的相互作用和調(diào)控機(jī)制以及其近年來在發(fā)酵食品領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行概述，并對(duì)如何構(gòu)建穩(wěn)定、高效的發(fā)酵微生物群落進(jìn)行了展望，旨在為合成微生物群落在發(fā)酵食品行業(yè)的進(jìn)一步深入研究及開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 合成微生物群落的特征

與單菌種或自然群落相比，合成微生物群落具有以下特征：①相較于單菌種，微生物群落具有更廣泛的代謝靈活性，通過物種間交流能夠更有效地催化許多復(fù)雜過程，執(zhí)行對(duì)單個(gè)菌株來說很難甚至是不可能完成的復(fù)雜任務(wù)[6-7]；②與自然微生物群落相比，合成微生物群落往往更傾向于生態(tài)理論的研究，因?yàn)楹铣傻奈⑸锶郝渲械奈锓N是已知的，具有明確的遺傳特性，且復(fù)雜性較低、可控性較強(qiáng)[4，8]；③與單菌種相比，群落中微生物物種豐富，可以將復(fù)雜的代謝途徑進(jìn)行劃分，通過成員間的勞動(dòng)分工和資源交換可以降低細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)[9-10]；④由于遺傳存在著不穩(wěn)定性，對(duì)于單菌種來說生長(zhǎng)環(huán)境的改變會(huì)對(duì)其產(chǎn)生干擾，使其產(chǎn)生不需要的副產(chǎn)物，而微生物群落中混合物種代謝模式多樣，且菌種間存在溝通和交流，使其比單一菌種具有更高的穩(wěn)定性，對(duì)待外界環(huán)境的擾動(dòng)具有更高的抵抗性[11-12]；⑤合成微生物群落與自然微生物群落相比物種較少，且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，可以從分子系統(tǒng)理論出發(fā)，通過網(wǎng)絡(luò)推理和元組數(shù)據(jù)的動(dòng)態(tài)建模進(jìn)行描述，并且由此可以用來開發(fā)和驗(yàn)證更復(fù)雜的、系統(tǒng)的模型[13-14]。

2 合成微生物群落相互作用和調(diào)控機(jī)制研究

在自然界中，群落的的穩(wěn)定性通常是通過群落中微生物間的相互作用來調(diào)節(jié)，因此構(gòu)建微生物群落必須要考慮微生物間可能存在的相互作用形式，物種間相互作用形式一般分為：通過交叉喂養(yǎng)的方式進(jìn)行代謝相互作用，通過代謝物和自誘導(dǎo)信號(hào)分子的傳遞進(jìn)行種間相互作用，以及在環(huán)境的刺激下進(jìn)行種間相互作用，因此可以通過改變細(xì)胞交流、物種代謝作用、生長(zhǎng)環(huán)境等方式對(duì)微生物間的相互作用進(jìn)行調(diào)控，從而對(duì)合成微生物群落進(jìn)行改造，實(shí)現(xiàn)特定的功能。

2.1 微生物間的相互作用研究

自然界中大多數(shù)微生物并不是作為一個(gè)獨(dú)立的個(gè)體單獨(dú)存在的，而是作為一個(gè)復(fù)雜的、高度多樣化和高度動(dòng)態(tài)化的微生物群落中的一部分而存在的，在群落中成員之間存在著相互交流和合作，通過成員間的相互作用來影響著群落的行為表現(xiàn)，進(jìn)而影響著群落的應(yīng)用[2]。群落中物種間的相互作用機(jī)制一直是生態(tài)學(xué)研究者熱點(diǎn)研究的領(lǐng)域，因?yàn)槲锓N間不同類型的相互作用不僅是影響微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的主要因素之一，同時(shí)也被認(rèn)為是影響生物多樣性產(chǎn)生的關(guān)鍵因素之一[15]。在自然群落中，微生物與其他系統(tǒng)發(fā)育類群的微生物不斷相互作用，從而形成復(fù)雜的生態(tài)相互作用網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)研究物種間的相互作用可以分為積極的和消極的兩種類型，積極的相互作用包括共生（互利共生和偏利共生），消極的相互作用包括寄生、捕食以及競(jìng)爭(zhēng)[16]。由于菌種間存在復(fù)雜的交互關(guān)系，因此在構(gòu)建微生物群落時(shí)要考慮參與菌種的功能、分布和生長(zhǎng)環(huán)境等眾多因素，而不是將多種微生物進(jìn)行的隨機(jī)組合。

2.2 基于代謝作用對(duì)微生物間相互作用調(diào)控

在合成微生物群落中的微生物之間可以通過交換代謝物進(jìn)行交流，利用資源的共享實(shí)現(xiàn)微生物間的相互作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)在利用蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和泡囊短波單胞菌（Brevundimonas naejangsanensis）混菌發(fā)酵生產(chǎn)氫的過程中存在基于代謝物交換介導(dǎo)的相互作用。在發(fā)酵過程中蠟樣芽孢桿菌通過代謝作用能夠?qū)⒌矸坜D(zhuǎn)化為乳酸，其作為碳源和電子供體，為泡囊短波單胞菌的細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)氫提供支持；作為回報(bào)，泡囊短波單胞菌通過代謝產(chǎn)生甲酸鹽，作為電子載體穿梭到蠟樣芽孢桿菌并供其利用，促進(jìn)了氫的產(chǎn)生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)混合菌株分別與兩株單菌種發(fā)酵相比，淀粉的利用率提高了14.7%和27.5%，氫的產(chǎn)量提高了42.3%和58.2%，從而有效的克服了單一菌株在代謝工程中存在的局限性[18]。此外，群落中的微生物還可以通過交換代謝中間物來影響彼此的活動(dòng)，這些代謝中間物可以促進(jìn)或抑制對(duì)方的生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)物種間的相互作用，進(jìn)而協(xié)調(diào)整個(gè)群落的活動(dòng)[19]。

2.3 基于細(xì)胞交流對(duì)微生物間相互作用調(diào)控

在微生物群落中，一些微生物之間存在的細(xì)胞交流是基于分泌特定的分子產(chǎn)生的，使得微生物之間存在著許多以不同小分子為依賴的相互作用[20]。目前研究最為普遍的細(xì)胞交流方式是基于群感效應(yīng)的專有信號(hào)分子的傳導(dǎo)，這些信號(hào)分子包括細(xì)胞產(chǎn)生的胞外酶、次級(jí)代謝物等，同時(shí)微生物還可以利用與新陳代謝和生長(zhǎng)有關(guān)的化學(xué)物質(zhì)來建立細(xì)胞間的相互作用[21]。細(xì)菌能夠釋放信號(hào)小分子，當(dāng)信號(hào)小分子在周圍介質(zhì)中積累并達(dá)到一定濃度時(shí)可以與其他細(xì)菌進(jìn)行交流，通過群落變化來感知鄰近物種的存在，測(cè)量它們的細(xì)胞密度，調(diào)節(jié)它們的基因表達(dá)，協(xié)調(diào)它們的團(tuán)體行為，從而實(shí)現(xiàn)了特定的功能[8，22]。研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）與白色念珠菌（Candida albicans）之間存在著的相互作用是理解真菌和細(xì)菌如何通過群體感應(yīng)系統(tǒng)相互調(diào)節(jié)的重要模型。通過將銅綠假單胞菌和白色念珠菌共培養(yǎng)時(shí)，銅綠假單胞菌可以合成2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮和3-氧-十二烷-高絲氨酸-內(nèi)酯等小分子，從而構(gòu)成復(fù)雜的群體感應(yīng)系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中，銅綠假單胞菌可以附著在絲狀形式的白色念珠菌上，并合成許多包括苯亞胺、綠膿桿菌、溶血性磷脂酶等小分子，從而有效的抑制白色念珠菌產(chǎn)生有毒物質(zhì)，減少對(duì)人體的傷害[23]。

2.4 基于環(huán)境因素對(duì)微生物間相互作用調(diào)控

在微生物群落中，微生物的生長(zhǎng)環(huán)境不僅影響著微生物的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)還影響群落的物種組成，進(jìn)而影響著微生物間的相互作用。因此在構(gòu)建微生物群落時(shí)可以通過改變物種的生存環(huán)境，如改變?nèi)郝洵h(huán)境中的溫度、濕度、氧氣水平、培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的可利用性以及環(huán)境中有毒化合物的存在與否等因素，來協(xié)調(diào)群落的物種組成，促進(jìn)物種間的相互作用，從而對(duì)合成微生物群落進(jìn)行改造，實(shí)現(xiàn)特定的功能[24-25]。研究發(fā)現(xiàn)在利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis）混菌發(fā)酵面團(tuán)時(shí)可以通過控制氧氣的供應(yīng)來促進(jìn)釀酒酵母與舊金山乳桿菌之間的相互作用。在發(fā)酵過程中釀酒酵母可以通過代謝作用將糖類轉(zhuǎn)化為CO2，體系中大量CO2的生成為厭氧型乳酸菌舊金山乳桿菌提供呼吸保護(hù)，使其免受氧的抑制，從而有效的促進(jìn)了舊金山乳桿菌細(xì)胞的生長(zhǎng)；同時(shí)舊金山乳桿菌通過代謝作用可將麥芽糖和蛋白質(zhì)水解為葡萄糖和氨基酸等物質(zhì)，以供釀酒酵母利用，混菌相互作用改變了面團(tuán)發(fā)酵體系中微生物的生長(zhǎng)環(huán)境，促進(jìn)了二者的生長(zhǎng)，使面團(tuán)的發(fā)酵時(shí)間對(duì)比單菌株縮短，面團(tuán)中氨基酸含量提高，這對(duì)面團(tuán)品質(zhì)的提高有著重要的意義[26-27]。

3 合成微生物群落的應(yīng)用

近年來，隨著科技的不斷發(fā)展和對(duì)單菌種研究的不斷增加，通過將理論與技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建出穩(wěn)定高效的微生物群落，使得合成微生物群落應(yīng)用不斷擴(kuò)展，其中包括發(fā)酵食品領(lǐng)域主要涉及醬油、白酒、食醋、酸奶等的生產(chǎn)應(yīng)用。

3.1 醬油生產(chǎn)應(yīng)用

微生物在醬油釀造的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，我國醬油生產(chǎn)多采用單一的米曲霉（Aspergillus oryzae）純種制曲，利用米曲霉制曲時(shí)分泌的各種酶來分解原料中的蛋白質(zhì)、淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)并進(jìn)一步發(fā)酵而成[28]。單一米曲霉制曲時(shí)對(duì)所需原料要求相對(duì)簡(jiǎn)單，對(duì)微生物的生長(zhǎng)所需的參數(shù)易控制，但其代謝產(chǎn)物的種類和含量不豐富，導(dǎo)致產(chǎn)品的風(fēng)味物質(zhì)不足。很多研究者通過構(gòu)建多菌種的合成微生物群落制曲、發(fā)酵醬油，在制曲階段選育多種遺傳背景已知釀造微生物進(jìn)行混合制曲，通過微生物間的相互交流和互補(bǔ)，來提高醬油產(chǎn)品風(fēng)味和生物活性成分[29-30]。如PENG M Y等[31]研究發(fā)現(xiàn)，通過將米曲霉和黑曲霉（Aspergillus niger）混合制曲能夠提高蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶的活力，增加了原料中蛋白質(zhì)和淀粉的水解效果，同時(shí)在總酚含量、總黃酮含量、三種異黃酮苷元（大豆苷元、糖苷元、染料木素）和抗氧化活性方面，混菌發(fā)酵均高于純種制曲發(fā)酵，這對(duì)提高醬油的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要作用。

3.2 白酒生產(chǎn)應(yīng)用

傳統(tǒng)白酒的釀造屬于典型的自然發(fā)酵，發(fā)酵體系中存在著以酵母為主的復(fù)雜微生物結(jié)構(gòu)，然后通過這些微生物的生物轉(zhuǎn)化完成了白酒的釀造。根據(jù)酵母在釀酒中的作用，可將酵母分為釀酒酵母和非釀酒酵母兩大類。釀酒酵母具有較高的發(fā)酵速率和發(fā)酵能力，在白酒釀造中主要完成酒精的發(fā)酵，同時(shí)通過代謝作用能夠產(chǎn)生高級(jí)醇類、酯類、有機(jī)酸等多種揮發(fā)性物質(zhì)[32]。相對(duì)于釀酒酵母，非釀酒酵母雖然發(fā)酵能力較低，但具有較強(qiáng)的產(chǎn)酶能力，能夠?qū)⒃现械那绑w物質(zhì)經(jīng)過一系列生化反應(yīng)形成酸、酯、醛和高級(jí)醇等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，同時(shí)這些菌在白酒發(fā)酵過程中還能有效抑制一些腐敗菌的繁殖，這對(duì)提高白酒的品質(zhì)有著重要作用[33-34]。隨著白酒市場(chǎng)的不斷擴(kuò)大，人們對(duì)白酒品質(zhì)的要求也更加嚴(yán)格，所以由傳統(tǒng)的單一菌種釀造向混菌釀造方面成為了研究熱點(diǎn)，有研究發(fā)現(xiàn)與酵母單獨(dú)釀造相比，酵母混菌發(fā)酵出的白酒風(fēng)味物質(zhì)更加豐富[35-36]。如ZHA M S等[37]利用釀酒酵母和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）混菌發(fā)酵釀造白酒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵提高了酵母的細(xì)胞代謝活性，促進(jìn)了發(fā)酵液中乙醇和乙酸乙酯的生成，從而有效改善了發(fā)酵液的風(fēng)味特性，提高了白酒的品質(zhì)。

3.3 食醋生產(chǎn)應(yīng)用

食醋在釀造過程中由于原料和曲中微生物的自發(fā)富集形成了復(fù)雜的菌群結(jié)構(gòu)，不同地區(qū)由于食醋群落結(jié)構(gòu)的差異造成了食醋風(fēng)味的差異。隨著對(duì)食醋中微生物群落研究的深入，利用合成功能菌群來增強(qiáng)食醋中的風(fēng)味特征和功能物質(zhì)已獲得突破[38]。乙偶姻是食醋的一種重要風(fēng)味物質(zhì)，也是食醋中活性成分川芎嗪的前體之一，其含量對(duì)食醋品質(zhì)有著重要的影響[39]。為了提高食醋中乙偶姻的含量，可以通過向食醋中直接添加食品級(jí)的乙偶姻或者利用內(nèi)源性微生物強(qiáng)化兩種方法。而目前市面上銷售的食品級(jí)乙偶姻多是通過化學(xué)方法合成不僅價(jià)格昂貴，而且直接添加也可能會(huì)因?yàn)榛瘜W(xué)物質(zhì)的引入而影響食醋的安全性，因此采用內(nèi)源性微生物強(qiáng)化的方法來提高乙偶姻的產(chǎn)量成為了研究熱點(diǎn)，相較于前一種方法，這種方法不僅降低了乙偶姻的生產(chǎn)成本，而且更加健康安全[40-41]。已有研究揭示了巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianum）和5種乳酸菌（（短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、布氏乳桿菌（Lactobacillus brucei）和發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum））是合成乙偶姻相關(guān)的功能菌[42-43]。邱婷[44]以這6株功能菌株為研究對(duì)象，分別利用這幾種乳酸菌和醋桿菌進(jìn)行混菌發(fā)酵合成乙偶姻，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與單菌種發(fā)酵相比干酪乳桿菌和巴氏醋桿菌構(gòu)成混菌體系可顯著提高乙偶姻含量，同時(shí)促進(jìn)了酯類物質(zhì)的積累，這為傳統(tǒng)食醋中乙偶姻的強(qiáng)化生產(chǎn)指明方向，對(duì)提高食醋的品質(zhì)有著重要的意義。

3.4 酸奶生產(chǎn)應(yīng)用

由于傳統(tǒng)的酸奶發(fā)酵過程開放程度高，容易滋生和感染各種雜菌，導(dǎo)致其發(fā)酵產(chǎn)物不穩(wěn)定，影響了酸奶的品質(zhì)。因此有研究者提出通過從優(yōu)質(zhì)酸奶中分離出其中的功能菌群并加以利用，來提高酸奶的品質(zhì)[45-46]。酸奶中的風(fēng)味物質(zhì)主要來源于微生物對(duì)原料中乳糖、蛋白質(zhì)的分解代謝，已有研究發(fā)現(xiàn)與單一的發(fā)酵劑相比，利用混菌作為發(fā)酵劑可有效改善酸奶的風(fēng)味特性，提高酸奶的品質(zhì)[47]。目前商業(yè)生產(chǎn)酸奶一般采用嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）混菌作為發(fā)酵劑，通過兩種菌的協(xié)同作用加快了酸奶的酸化速率，提高了酸奶中芳香化合物的含量，增強(qiáng)了酸奶的營養(yǎng)價(jià)值[48]。隨著對(duì)酸奶中益生菌研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)胃酸和膽汁對(duì)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌具有較強(qiáng)的殺傷作用，使其無法在腸道內(nèi)定植，從而使其有益作用受到了極大限制[49]。研究者通過模擬胃腸道實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）具有較強(qiáng)的胃酸和膽汁鹽耐受性，可在腸道內(nèi)大量存活，且嗜酸乳桿菌還具有較強(qiáng)產(chǎn)酸能力，適用于酸奶的發(fā)酵[50-51]。如李子葉等[52-53]以牛奶作為發(fā)酵基質(zhì)，利用嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）混菌發(fā)酵酸奶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未加嗜酸乳桿菌的發(fā)酵組相比其產(chǎn)酸速率更快，酸奶中的活菌數(shù)更多，乙醛等風(fēng)味物質(zhì)含量更高，同時(shí)嗜酸乳桿菌還具有降低膽固醇含量、增強(qiáng)人體免疫力的作用，這對(duì)酸奶的益生功能的進(jìn)一步增強(qiáng)有著重要的意義。

4 總結(jié)和展望

合成的微生物群落不僅可控性高、穩(wěn)定性好，而且還能夠通過微生物之間的相互作用執(zhí)行單一菌株難以完成的復(fù)雜任務(wù)，使其成了發(fā)酵食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。中國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品屬于典型的自然發(fā)酵，發(fā)酵過程中由于開放程度較高，使得發(fā)酵體系中微生物構(gòu)成復(fù)雜，因此發(fā)酵完成不僅僅取決于單個(gè)微生物作用的疊加，還依賴著微生物間復(fù)雜的交互作用?，F(xiàn)階段對(duì)食品發(fā)酵微生物種群的作用關(guān)系和代謝網(wǎng)絡(luò)的研究較少，想要調(diào)控微生物群落的發(fā)酵功能必須了解參與各種發(fā)酵生化反應(yīng)的微生物，通過代謝網(wǎng)絡(luò)模塊化處理將發(fā)酵任務(wù)分解，確定關(guān)鍵微生物的單元任務(wù)，并通過調(diào)節(jié)發(fā)酵參數(shù)和強(qiáng)化菌株功能來實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)微生物群落的代謝功能的目標(biāo)。今后隨著對(duì)于食品微生物群落的組成、功能和相互作用的深入研究，借助合成微生物群落的理論和研究方法，設(shè)計(jì)和構(gòu)建出穩(wěn)定高效的靶向精準(zhǔn)的合成食品發(fā)酵微生物群落，將對(duì)我國發(fā)酵食品發(fā)展進(jìn)步有著重要意義。