馬衛(wèi)紅，趙福瓊，劉海繁，姚紅艷，李衛(wèi)鵬，錢(qián) 林，歐德淵*

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.惠水縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 惠水 550600；3.長(zhǎng)順縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 長(zhǎng)順 557000）

禽流感（avian influenza，AI）是由正黏病毒（avian influenza virus，AIV）引起的禽類(lèi)傳染病。根據(jù)病毒的毒力不同，分為高致病性和低致病性禽流感[1]。低致病性禽流感（LPAI）能感染禽類(lèi)，各種日齡的家禽都可發(fā)生感染[2]，常能引起雞的炎性損傷[3]。低致病性H9N2AIV 能感染人和多種哺乳動(dòng)物[4]，并引起一定程度的炎性損傷[5]。白細(xì)胞介素2（interleukin-2，IL-2）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）在機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥性腸病患者血清TNF-α、IL-2 水平表達(dá)上升[6]。IL-2 主要由CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞和NK 細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫均有良好的促進(jìn)和提升作用，而TNF-α 作為重要的炎癥細(xì)胞因子，對(duì)免疫具有調(diào)節(jié)作用。史丹丹等[7]研究表明，鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）能參與介導(dǎo)急性骨骼肌炎癥反應(yīng)。CaM可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度，或者直接參與介導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)。AIV感染不同種類(lèi)動(dòng)物，引起的癥狀不同，可能跟機(jī)體的免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)有關(guān)。試驗(yàn)通過(guò)觀察雞、鴨和小鼠外周血中IL-2 和TNF-α 以及肺組織中CaM的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況，了解低致病性H9N2AIV對(duì)雞、鴨和小鼠造成炎性損傷的情況，以期為低致病性禽流感對(duì)不同種類(lèi)動(dòng)物致病機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

24 只52 日齡黑羽烏骨雞和24 只52 日齡櫻桃谷肉鴨購(gòu)自貴陽(yáng)綠源禽業(yè)有限公司。24 只6～8 周齡昆明系小鼠購(gòu)自貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院。

1.2 病毒

雞源H9N2AIV，EID50=10-7.62，由貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并饋贈(zèng)。

1.3 試驗(yàn)試劑

雞、鴨和小鼠IL-2、TNF-α、CaM ELISA 試劑盒均購(gòu)自科諾迪生物有限公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶、SYBR Premix Ex Tap Ⅱ均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

按動(dòng)物種類(lèi)將24 只雞、24 只鴨和24 只小鼠隨機(jī)分成4組，0、3、6、9 d作為分組標(biāo)記。0 d作為陰性組，靜脈注射0.2 mL PBS，12 h 后采集其外周血和肺組織，3、6、9 d 作為陽(yáng)性組，參考文獻(xiàn)靜脈注射0.2 mL H9N2AIV[8]，在感染AIV 3、6、9 d后分別采集其外周血和肺組織。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 IL-2、TNF-α含量

按照雞、鴨和小鼠IL-2、TNF-α ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.2 CaM mRNA水平

參照GenBank中相關(guān)序列和參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)雞、鴨和小鼠β-actin內(nèi)參基因及CaM基因引物，見(jiàn)表1。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。用Trizol法提取各組肺組織中的總RNA，轉(zhuǎn)化為cDNA 后進(jìn)行熒光RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：SYBR Premix Ex Tap Ⅱ5 μL、模板1 μL、上下游引物各0.5 μL、ddH2O 3 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；55 ℃退火、延伸30 s，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)，共40 個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后溫度降到65 ℃，再以0.5 ℃、20 s升溫至95 ℃并檢測(cè)熒光信號(hào)得到熔解曲線。經(jīng)熒光檢測(cè)后得到相應(yīng)的CT值，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算各組動(dòng)物CaM的相對(duì)表達(dá)量。

表1 雞、鴨和小鼠β-actin內(nèi)參基因及CaM基因引物Tab.1 The β-actin gene and CaM gene primers in chicken,duck and mice

1.5.3 CaM含量

將雞、鴨和小鼠肺組織加等量的PBS 研磨后，取上清液-20 ℃冷凍保存，按照CaM ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，計(jì)算各組動(dòng)物肺組織中CaM的含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 20 軟件進(jìn)行單因素方差分析，應(yīng)用Duncan's法進(jìn)行組間數(shù)據(jù)的多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 H9N2 AIV 對(duì)雞、鴨和小鼠血清中IL-2 含量的影響（見(jiàn)表2）

表2 H9N2 AIV對(duì)雞、鴨和小鼠血清中IL-2含量的影響Tab.2 Effect of H9N2 AIV on the serum IL-2 content of chickens,ducks and mice（n=6） 單位：ng/L

由表2可知，與0 d（感染前）比，雞的IL-2濃度在感染H9N2AIV 3、6、9 d后均顯著升高（P＜0.05）；鴨的IL-2濃度在感染H9N2AIV 3、9 d后顯著升高（P＜0.05），6 d后極顯著升高（P＜0.01）；小鼠的IL-2濃度在感染H9N2AIV 3 d后顯著升高（P＜0.05），6 d后極顯著升高（P＜0.01）。在感染H9N2AIV前后，鴨的IL-2濃度最高，其次是小鼠，最后是雞。

2.2 H9N2 AIV 對(duì)雞、鴨和小鼠血清中TNF-α 含量的影響（見(jiàn)表3）

表3 H9N2 AIV對(duì)雞、鴨和小鼠血清中TNF-α含量的影響Tab.3 Effect of H9N2 AIV on the serum TNF-α content of chickens,ducks and mice（n=6） 單位：ng/L

由表3 可知，與0 d（感染前）比，雞的TNF-α 濃度在感染H9N2AIV 6、9 d 后均顯著升高（P＜0.05）；鴨的TNF-α 濃 度 在 感 染H9N2AIV 6 d 后 極 顯 著 升 高（P＜0.01），9 d 后顯著升高（P＜0.05）；小鼠的TNF-α 濃度在感染H9N2AIV 3、6、9 d 后顯著升高（P＜0.05）。在感染H9N2AIV 前后，小鼠的TNF-α 濃度最高，其次是鴨，最后是雞。

2.3 H9N2 AIV對(duì)雞、鴨和小鼠肺組織CaM的影響

2.3.1 H9N2AIV 對(duì)雞、鴨和小鼠肺組織CaM 轉(zhuǎn)錄的影響（見(jiàn)表4）

表4 H9N2 AIV對(duì)雞、鴨和小鼠肺組織CaM轉(zhuǎn)錄的影響Tab.4 Effect of H9N2 AIV on CaM transcription in lung tissues of chickens,ducks and mice（n=6）

由表4可知，與0 d（感染前）比，雞的CaM轉(zhuǎn)錄水平在感染H9N2AIV 3、9 d 后顯著升高（P＜0.05），6 d 后極顯著升高（P＜0.01）；鴨的CaM轉(zhuǎn)錄水平在感染H9N2AIV 6 d后顯著升高（P＜0.05）；小鼠的CaM轉(zhuǎn)錄水平在感染H9N2AIV 3 d后顯著升高（P＜0.05），6 d后極顯著升高（P＜0.01）。在感染H9N2AIV 3、6、9 d后雞的CaM轉(zhuǎn)錄水平均高于鴨和小鼠。

2.3.2 H9N2AIV 對(duì)雞、鴨和小鼠肺組織CaM 含量的影響（見(jiàn)表5）

表5 H9N2 AIV對(duì)雞、鴨和小鼠肺組織CaM含量的影響Tab.5 Effect of H9N2 AIV on the content of CaM in lung tissues of chickens,ducks and mice（n=6） 單位：μg/L

由表5可知，與0 d（感染前）比，雞的CaM含量在感染H9N2AIV 6 d 后極顯著降低（P＜0.01），9 d 后顯著降低（P＜0.05）；鴨的CaM含量在感染H9N2AIV 9 d后極顯著降低（P＜0.01）；小鼠的CaM含量在感染H9N2AIV 6 d后極顯著降低（P＜0.01）。在感染H9N2AIV 3、6、9 d 后，雞的CaM含量最高，其次是鴨，最后是小鼠。

3 討論

3.1 H9N2 AIV對(duì)雞、鴨和小鼠IL-2、TNF-α含量的影響

研究表明，禽流感感染患者體內(nèi)血清細(xì)胞因子水平顯著升高[9]，通常情況下宿主感染AIV 后會(huì)立即產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，隨后啟動(dòng)局部或全身的炎癥反應(yīng)[10]。IL-2可以激活巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等能產(chǎn)生TNF-α、INF-α和NO細(xì)胞因子，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)[11]。IL-2對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)具有促進(jìn)作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)，人工感染H9N2AIV 后第4 d 雞腦組織中IL-2 的mRNA 含量極顯著上調(diào)[13]。而TNF-α作為典型的炎癥細(xì)胞因子，也是最重要的促炎因子，可以直接參與炎癥反應(yīng)[14-15]。TNF-α適量的表達(dá)，有助于激活機(jī)體的免疫，但過(guò)量表達(dá)就會(huì)造成炎性損傷，甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。在試驗(yàn)中，在感染AIV 3 d 后雞、鴨和小鼠IL-2 含量均顯著升高，6 d 時(shí)鴨和小鼠的IL-2 含量極顯著升高，而在感染AIV 6d 后雞和小鼠的TNF-α 含量均顯著升高，鴨極顯著升高，說(shuō)明在感染AIV后雞、鴨和小鼠均發(fā)生了免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)，在6 d 時(shí)3種動(dòng)物的免疫和炎性反應(yīng)最為明顯，而3種動(dòng)物相比，鴨的IL-2 和TNF-α 變化最明顯，小鼠的IL-2 變化最明顯。大量研究結(jié)果表明，雞與鴨的免疫反應(yīng)基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)特征具有顯著差異，這些差異可能與它們對(duì)AIV抵抗力不同相關(guān)[17]。而鴨和小鼠在感染AIV 前后，IL-2、TNF-α 濃度均較雞高，可能鴨和小鼠感染AIV無(wú)明顯癥狀與細(xì)胞因子參與免疫反應(yīng)有關(guān)。

3.2 H9N2 AIV 對(duì)雞、鴨和小鼠CaM mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平及含量的影響

CaM在動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞內(nèi)能與很多配體相互作用，參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、代謝、細(xì)胞凋亡、肌肉收縮、記憶活動(dòng)、神經(jīng)生長(zhǎng)及免疫反應(yīng)等生命活動(dòng)[18]，同時(shí)CaM可以直接參與動(dòng)物機(jī)體的炎癥和炎性反應(yīng)[19]。Ca2+被稱(chēng)為是細(xì)胞內(nèi)的第二信使，而CaM可通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)Ca2+濃度來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能[20]。若發(fā)生細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、Ca2+分布紊亂，就有可能引起細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[21]。在細(xì)胞凋亡和自噬過(guò)程中，Ca2+引起的依賴(lài)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制涉及不同的CaM調(diào)控系統(tǒng)[22]，而自噬過(guò)程可以通過(guò)Akt-mTOR、MAPK 和NF-κB信號(hào)等通路參與H9N2AIV 誘導(dǎo)的急性肺損傷[23]。感染AIV 后，雞、鴨和小鼠的CaM 的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，在6 d時(shí)達(dá)到最大值，這與其炎性反應(yīng)是一致的。但雞和小鼠在感染AIV 后6 d的CaM 表達(dá)量卻極顯著下降，而鴨在感染后9 d CaM表達(dá)量極顯著下降，CaM可能參與炎性反應(yīng)的初始階段，對(duì)炎性反應(yīng)有促進(jìn)作用，或許是直接參與炎性反應(yīng)，所以導(dǎo)致CaM 的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。H9N2AIV 感染可抑制雞的免疫應(yīng)答，其中對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答的抑制更為明顯[24]，所以對(duì)CaM 的表達(dá)有抑制作用，可能通過(guò)抑制CaM 的表達(dá)來(lái)減輕機(jī)體的免疫反應(yīng)，但AIV 如何影響CaM mRNA 的轉(zhuǎn)錄和CaM 的蛋白表達(dá)，其機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

本研究表明，鴨和小鼠外周血IL-2、TNF-α 含量在感染前后均比雞高，而鴨和小鼠肺的炎性損傷也較雞輕，說(shuō)明AIV 造成的炎性損傷可能與IL-2、TNF-α 含量有關(guān)。感染AIV后，CaM在3種動(dòng)物肺組織中的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，但其在肺組織中的含量下降，說(shuō)明CaM 在AIV 造成的肺組織炎性損傷中可能起重要作用，但AIV對(duì)CaM的表達(dá)有抑制作用，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。