田欣欣 武莉 張海玲 楊菁

中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所，天津市生物醫(yī)學材料重點實驗室，天津300192

0 引 言

當前，核技術(shù)在軍事、醫(yī)學及核能源等方面的應用越來越廣泛，但輻射暴露對人類健康也存在巨大威脅。當機體在短時間內(nèi)受到大于1 Gy的電離輻射時，就會引發(fā)急性放射病，并出現(xiàn)感染、出血等一系列并發(fā)癥，甚至導致死亡，因此將這些輻射引起的癥候群統(tǒng)稱為急性輻射綜合征（acute radiation syndrome，ARS）。根據(jù)輻照劑量及臨床特征，可將急性放射病分為骨髓型、腸型和腦型。骨髓型ARS即造血系統(tǒng)損傷，主要表現(xiàn)為全血細胞減少，其機制為細胞對輻射的敏感性與細胞的分化程度成反比，如造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）、腸干細胞（intestinal stem cell，ISC）等分化程度越低的細胞對輻射敏感性越高[1]。整個造血系統(tǒng)功能的正常發(fā)揮主要依賴于HSC，因此造血系統(tǒng)對電離輻射很敏感，在輻射劑量超過1 Gy時即可發(fā)生損傷。而全血細胞減少可誘發(fā)感染和出血等癥狀，是核暴露導致人類死亡的主要原因[2]。腸型ARS發(fā)生在輻照劑量較大時，主要表現(xiàn)為腸黏膜和血管的完整性快速喪失，這會導致腸道對營養(yǎng)物質(zhì)和液體的吸收不良以及腸道屏障功能的喪失。腸型ARS患者在輻射暴露7～10 d后即出現(xiàn)脫水、敗血癥和出血等癥狀，若不進行治療，最終將會導致死亡[3]。因此降低ARS死亡率的關(guān)鍵是維持造血系統(tǒng)的穩(wěn)定和腸道組織的完整性。臨床治療除了抗感染、補液和營養(yǎng)支持等基礎性治療外，還包括輻射暴露后24 d內(nèi)盡快使用促進造血和腸黏膜修復的細胞因子進行治療。

在大多數(shù)輻射事故中，通常會保留部分骨髓細胞[4]。造血修復相關(guān)的細胞因子可刺激患者自身保留的骨髓HSC，誘導HSC向粒細胞、紅細胞和血小板進行分化，維持血液系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，降低感染和出血的風險，從而減緩輻射損傷癥狀的發(fā)生并提高輻射暴露后的生存率。腸道修復相關(guān)細胞因子可刺激ISC的增殖分化和上皮細胞的遷移，快速恢復小腸組織的完整性，發(fā)揮營養(yǎng)吸收和屏障功能，避免感染和敗血癥的發(fā)生。

1 ARS治療相關(guān)細胞因子

1.1 造血修復相關(guān)細胞因子

1.1.1 粒細胞集落刺激因子

粒細胞減少是輻射損傷誘導感染的主要因素之一。粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulatingfactor，G-CSF）可刺激自體保留的HSC向中性粒細胞分化，降低感染風險，對受到致死劑量輻射小鼠的造血和生存具有積極作用[5-6]，因此成為ARS治療的金標準。G-CSF應在輻射暴露后24 h內(nèi)盡快給藥，且當中性粒細胞絕對值小于500個/μl時，更強烈推薦使用G-CSF。目前，G-CSF已被美國食品藥品監(jiān)督管理局確定為突發(fā)輻射公共衛(wèi)生事件儲備藥物[7]。

1.1.2 粒細胞巨噬細胞集落刺激因子

粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor，GM-CSF）可刺激HSC向粒細胞（中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞）和單核細胞分化。因此GM-CSF比單純刺激中性粒細胞的G-CSF具有更廣泛的作用，臨床上用于各種原因引起的白細胞或粒細胞減少癥，同時被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于ARS的治療[7]。若不能在輻射暴露后24 h內(nèi)及時給予G-CSF細胞因子治療，在輻射暴露后48 h內(nèi)給予GM-CSF進行干預，依舊有效[8-9]。

1.1.3 白細胞介素12

白細胞介素12（interleukin-12，IL-12）具有調(diào)節(jié)造血和免疫的作用[10-13]，可用于治療ARS和放射治療導致的造血系統(tǒng)損傷。IL-12對放射治療后的外周血細胞下降、骨髓抑制、免疫功能異常等并發(fā)癥具有治療和保護作用[14]，但也有研究結(jié)果證明過量IL-12可誘導炎癥發(fā)生[10]。在急性移植物抗宿主病患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)IL-12高表達，對造血重建具有消極影響[15]。因此使用IL-12時應注意劑量問題。

1.1.4 血小板生長因子

血小板生長因子又稱IL-11，是一種刺激巨核細胞生長及分化的內(nèi)源性細胞因子，10年前被批準用于臨床治療慢性免疫性血小板減少癥。血小板減少導致的出血是造血系統(tǒng)損傷的主要癥狀之一[16]。相關(guān)動物研究結(jié)果表明，當在致死性全身輻照后第1、3或5天使用Nplate（一種血小板生長因子模擬劑），被輻射小鼠的存活率可高達100%[17]。此外，Nplate與其他細胞因子如G-CSF進行聯(lián)合治療，可有效改善外周血細胞水平并提高小鼠存活率。Wong等[18]的研究結(jié)果證明在LD30/45的輻射劑量下單獨使用Nplate或聯(lián)合G-CSF均可改善血小板水平。有趣的是，除了改善血小板水平外，兩者聯(lián)用還能進一步改善中性粒細胞水平，這表明Nplate與G-CSF聯(lián)用會產(chǎn)生協(xié)同效應。

1.2 腸黏膜修復相關(guān)細胞因子

1.2.1 表皮生長因子

表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）與受體結(jié)合可激活角質(zhì)細胞和真皮成纖維細胞生成，從而促進皮膚傷口愈合，被用于各種創(chuàng)面的愈合及胃腸道潰瘍的修復[19-22]。上皮細胞的再生對腸道損傷后的組織修復同樣至關(guān)重要。輻射暴露后隱窩細胞密度與輻射劑量呈負相關(guān)，并決定腸道黏膜損傷能否恢復[3]。ISC生態(tài)位可提供EGF信號，用以維持隱窩柱狀上皮的完整性[23]。因此EGF可有效促進輻射誘導的腸道損傷修復。

1.2.2 成纖維細胞生長因子2

成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）不僅可促進內(nèi)皮細胞的遷移和平滑肌細胞的增殖，還可減少輻射暴露后小腸隱窩干細胞的凋亡。FGF2受體抑制劑可增加非小細胞肺癌對放射治療的敏感性，也從側(cè)面提示FGF2對被輻射細胞具有保護作用[24]。Kim等[25]證明FGF2處理可促進大鼠小腸隱窩上皮細胞IEC-6的增殖，減少凋亡；輻射后給予FGF2可改善小腸上皮組織的不完整，增加隱窩干細胞的存活數(shù)量，提高大鼠的生存率；FGF2與骨髓移植聯(lián)合治療輻射腸道綜合征可取得更好的治療效果。但FGF2在輻射腸道綜合征治療中的作用機制還有待進一步研究。

2 細胞因子的遞送

雖然細胞因子的治療可改善造血和恢復腸道完整性，提高生存率，但細胞因子的應用仍存在問題，如細胞因子的功能較單一[26]，在體內(nèi)易被酶降解、半衰期過短、需要一天多次或高劑量給藥[27]，毒性較大等[28]。通過對細胞因子本身進行修飾或開發(fā)新型遞送載體可能解決這些問題。

2.1 細胞因子的修飾

細胞因子的修飾主要是對其進行聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）化。PEG是一種無毒、水溶性的高分子聚合物，因其具有較大的流體動力學體積而在藥物周圍形成屏蔽，進而保護藥物免受腎臟清除、酶促降解和免疫細胞識別。大量研究結(jié)果證明蛋白質(zhì)的PEG化可有效延長蛋白質(zhì)在體內(nèi)的半衰期并降低蛋白質(zhì)在體內(nèi)的免疫原性[27]。動物實驗結(jié)果顯示，小鼠在全身輻照后24 h內(nèi)皮下注射PEG-G-CSF，造血重建得到明顯改善，血小板、紅細胞和中性粒細胞恢復加速，且致死劑量照射后30 d的生存實驗結(jié)果顯示，PEG-G-CSF組小鼠比G-CSF組具有更高的生存率[29]。目前在國內(nèi)外均已有PEG化的G-CSF藥物上市，如Neulasta和津優(yōu)力等。由于促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）的循環(huán)半衰期極短，在體內(nèi)幾乎無活性，PEG化后能明顯延長EPO在體內(nèi)的半衰期，發(fā)揮其促紅細胞生成的功能[30]。重組人IL-11被批準用于臨床治療癌癥患者放化療后的血小板減少癥，但其半衰期非常短，必須每天注射。PEG化的IL-11在靈長類動物藥代動力學實驗中的藥時曲線下面積較IL-11增加了79倍以上，循環(huán)半衰期可長達67 h[31-32]。

2.2 細胞因子的遞送系統(tǒng)

2.2.1 凝膠遞送系統(tǒng)

凝膠遞送系統(tǒng)因其良好的生物相容性、可注射性以及緩控釋等特點，被廣泛用于藥物和細胞因子的遞送。Song等[33]發(fā)現(xiàn)了一種在水溶液中自組裝形成的可注射多孔PEG-b-聚（L-丙氨酸）水凝膠，在自組裝過程中很容易將腫瘤細胞裂解物、GM-CSF和免疫檢查點抑制劑（抗細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4/程序性死亡受體1抗體）共同包裹于水凝膠中，在體內(nèi)持續(xù)釋放，招募和激活樹突狀細胞，并誘導強烈的T細胞反應，進一步增強免疫檢查點療法。

水凝膠近年來還被用于與納米粒子/膠束的聯(lián)合遞送。Rezaei等[34]將負載萬古霉素的絲素蛋白-海藻酸鈉納米粒子包埋于含有EGF的聚（N-異丙基丙烯酰胺）水凝膠中，用于金黃色葡萄球菌感染的大鼠燒傷創(chuàng)面再生。通過該技術(shù)，超過80%的EGF生物活性被保存，聚（N-異丙基丙烯酰胺）水凝膠可支持成纖維細胞的增殖和生長，且EGF在水凝膠中20 d大約釋放了30%。Sun等[35]設計了一種可注射的聚己內(nèi)酯-PEG-聚己內(nèi)酯熱敏水凝膠共包埋雞卵清蛋白納米粒子和GM-CSF，將水凝膠作為載疫苗和緩釋細胞因子的平臺招募樹突狀細胞，提高樹突狀細胞的抗原攝取效率，產(chǎn)生強烈的T細胞反應。

糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）的聚合物網(wǎng)絡可對細胞因子進行仿生管理，從而改變細胞功能，目前已成為一種功能多樣性的水凝膠變體[36]。肝素GAG本身具有較高的負電性，為大量不同趨化因子和生長因子的非共價絡合提供了可能。肝素結(jié)合EGF在水凝膠中與GAG結(jié)合可作為EGF的一個儲存庫，誘導EGF受體長期激活，促進傷口愈合[37]。對GAG水凝膠進行PEG修飾可調(diào)整物理特性、生物功能化和降解性以及編程宿主反應，且可在幾天內(nèi)快速融入組織。將PEG修飾的GAG水凝膠皮下植入C57BL/6小鼠長達28 d，僅引起輕微的異物反應[38]。

2.2.2 納米粒子遞送系統(tǒng)

納米粒子遞送系統(tǒng)具有提高生物利用度、靶向功能、降低藥物毒性和緩控釋等特點，被廣泛用于藥物遞送。納米粒子遞送系統(tǒng)在生物大分子的遞送方面也發(fā)揮著重要作用。Silva等[39]設計了一種殼聚糖修飾的透明質(zhì)酸納米粒子用于EPO的眼部給藥，提高EPO在眼部生物利用度的同時提高其保留時間和透過不同眼膜的能力。Margulis等[40]利用白蛋白的脫溶和熱變性能將水溶性熒光染料吲哚菁綠包裹在內(nèi)形成納米粒子，并在pH5.5時將G-CSF通過碳化二亞胺鍵連接到納米粒子表面，形成穩(wěn)定的納米結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果證明該納米粒子將G-CSF作為靶向配體，在體外和體內(nèi)均實現(xiàn)了卓越的髓系選擇性。

近些年細胞因子與小分子化學藥物的聯(lián)合遞送得到了廣泛研究。Hu等[41]先利用酸敏材料聚乙二醇單甲醚-Dlinkm-外消旋聚乳酸和泊洛沙姆F127負載紫杉醇制成納米粒子，然后利用泊洛沙姆F127的低溫膨脹作用使納米粒子膨脹變得疏松，便于IL-12吸附進入納米粒子的空隙中，實現(xiàn)疏水化學治療藥物紫杉醇和IL-12的共同遞送。該納米粒子可富集于腫瘤部位，激活T淋巴細胞和自然殺傷細胞釋放干擾素γ，誘導腫瘤相關(guān)巨噬細胞M1型分化，從而改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境，顯著抑制乳腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Bauleth-Ramos等[42]為了獲得免疫治療和化學治療的聯(lián)合作用，制備了精胺修飾的縮醛葡聚糖納米粒子，負載化學治療藥物Nutlin-3a和GMCSF，并在結(jié)直腸癌多細胞瘤球狀模型的二維培養(yǎng)和三維模型中進行測試，結(jié)果顯示該納米粒子可明顯抑制瘤細胞的增殖。

2.2.3 微球遞送系統(tǒng)

微球是指藥物分散或被吸附于高分子、聚合物基質(zhì)中而形成的微粒分散體系，被廣泛用于延長藥物的釋放周期。DeJulius等[43]證明傳統(tǒng)可降解聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]和活性氧響應型可降解聚硫丙烯的聚合物微粒子能有效包載EPO-R76E（一種EPO衍生物），并實現(xiàn)持續(xù)釋放，小鼠眼部注射后28 d仍可檢測到EPO-R76E。Liu等[44]先制備載有G-CSF、EPO和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的右旋糖酐納米粒，再將所得納米粒包裹于PLGA微球中獲得蛋白-右旋糖酐-PLGA微球。GCSF、EPO和VEGF在體外釋放可長達4周以上。將微球注射至缺血的大鼠后肢，VEGF、EPO和G-CSF聯(lián)合治療的促血管新生作用顯著高于單細胞因子治療。PLGA微粒雖可顯著延長細胞因子的釋放周期，但存在酸性降解產(chǎn)物和爆發(fā)性釋放的問題。為此，Ge等[45]利用雙乳液技術(shù)與微流控技術(shù)相結(jié)合的方法，成功制備了具有核殼結(jié)構(gòu)的PLGA/殼聚糖-肝素復合微粒，該復合微粒的細胞毒性和突釋（裝載FGF2和VEGF）均得以顯著降低。

2.2.4 脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)

脂質(zhì)雙分子層包括親水區(qū)和疏水區(qū)兩部分，可進行不同性質(zhì)藥物的聯(lián)合遞送，且具有無毒、無免疫源性及制備條件溫和等特點，被廣泛用于生物大分子和脂溶性化學小分子藥物的遞送。Lu等[46]制備了含有視黃酸可變形脂質(zhì)體和EGF陽離子可變形脂質(zhì)體的藥膏，用于治療深層燒傷。這兩種脂質(zhì)體均具有藥物包埋效率高、藥物持續(xù)釋放等特點。與游離藥物相比，這兩種脂質(zhì)體的皮膚通透性更強，藥物沉積分別增加2.9倍和18.8倍。制備的雙脂質(zhì)體軟膏在深層燒傷模型中可促進皮膚附屬物的形成并增加膠原蛋白的產(chǎn)生，協(xié)同促進傷口愈合。Le等[47]先制備含有馬來酰亞胺基團的姜黃素脂質(zhì)體（curcumin liposome，LP-Cur），然后將硫醇化的EGF通過馬來酰亞胺基團結(jié)合到LP-Cur表面，得到EGF-LP-Cur脂質(zhì)體囊泡。該脂質(zhì)體囊泡可靶向EGF受體，從而增強姜黃素對人胰腺癌細胞的抗腫瘤活性。

3 展望

ARS屬于全身性疾病，特別是暴露于高劑量輻射的情況下，同時伴有造血系統(tǒng)和腸黏膜的損傷。細胞因子用于ARS的治療可促進造血系統(tǒng)和腸黏膜損傷的修復，進而改善生存率。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ARS的治療中，多細胞因子的聯(lián)合應用比單細胞因子具有更好的治療效果，且通過對細胞因子進行PEG修飾或?qū)ζ溥f送載體進行修飾不僅可顯著延長細胞因子在體內(nèi)的半衰期，還可實現(xiàn)細胞因子與藥物的聯(lián)合遞送治療。除了具有治療作用的細胞因子和藥物，功能性載體材料也可應用于ARS的治療中。ARS的損傷機制主要是活性氧過量產(chǎn)生誘導了細胞凋亡，因此活性氧響應性材料可作為ARS治療的載體。一方面，活性氧響應性載體材料可攜帶細胞因子用于ARS治療，既可消除過量活性氧，減緩輻射損傷的進一步加深，又可發(fā)揮細胞因子對造血系統(tǒng)和腸黏膜損傷的修復作用。另一方面，造血相關(guān)細胞因子主要作用于骨髓HSC，因此可將造血相關(guān)細胞因子作為靶向分子，結(jié)合到活性氧響應性功能材料表面，靶向遞送至骨髓HSC，達到協(xié)同治療效果的同時降低藥物毒性。此外，骨髓移植是重癥ARS治療的主要有效手段，但異體骨髓細胞移植存在免疫排斥和移植細胞存活時間短等問題，可利用功能性材料對移植細胞進行工程化修飾，降低細胞的免疫原性，提高細胞在體內(nèi)的存活周期，進而提高骨髓移植的成功率。

志謝感謝天津市人才發(fā)展特殊支持計劃高層次創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團隊和天津市創(chuàng)新推進計劃重點領域“免疫活性生物材料”創(chuàng)新團隊

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