付文竹，蔡瑤，徐加發(fā)

1 廣東省藥品監(jiān)督管理局審評認(rèn)證中心，廣州市，510080

2 江蘇省食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證審評中心，南京市，210002

3 江蘇碩世生物科技股份有限公司，泰州市，225300

0 引言

自身免疫性疾病（autoimmune diseases）是指機(jī)體對自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病，總發(fā)病率在普通人群中約為3%～5%[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，近10年來全球自身免疫性疾病的發(fā)病率和患病率都處于上升階段[3]。當(dāng)人體有異常的免疫反應(yīng)后，會產(chǎn)生針對自身組織或器官的抗體，其中病理性自身抗體是產(chǎn)生自身免疫性疾病的重要原因之一。因此自身抗體本身成為了大多數(shù)自身免疫性疾病的重要血清學(xué)標(biāo)志物，其在疾病診斷、病情監(jiān)測及預(yù)后評估中發(fā)揮的作用日益受到重視。然而，對于大多數(shù)自身免疫疾病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，且缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化檢驗(yàn)方法，加上大多數(shù)抗體無公認(rèn)的溯源途徑、臨床實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制和管理水平不高、缺乏規(guī)范的結(jié)果判讀等因素，導(dǎo)致自身抗體類檢測試劑在產(chǎn)品注冊申報(bào)、臨床應(yīng)用過程中存在不規(guī)范的現(xiàn)象，因此對于此類產(chǎn)品從注冊和審評角度進(jìn)行梳理分析并給出建議，對于制造商、監(jiān)管者和臨床使用單位具有重要意義。

1 自身免疫性疾病及其抗體概述

自身免疫性疾病指的是自身的淋巴細(xì)胞或者抗原表位刺激機(jī)體產(chǎn)生的自身抗體，反過來作用于機(jī)體，引起疾病的過程[4]。自身抗體主要有兩種分類方法，根據(jù)自身抗原在體內(nèi)分布部位可分為器官特異性自身抗體和非器官特異性自身抗體。前者的自身抗原為某一器官的特定成分，病變也局限于該器官，如抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體、抗RA相關(guān)角蛋白抗體。后者的自身抗原為細(xì)胞核成分或線粒體或其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)，病變可出現(xiàn)在全身各種器官，如抗核抗體[5]。根據(jù)自身抗體臨床意義即敏感性和特異性不同又可分為疾病標(biāo)志性自身抗體如系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的抗Sm抗體、疾病特異性自身抗體如SLE中抗雙鏈DNA（敏感性70%～80%，特異性90%～95%）、疾病相關(guān)性自身抗體如原發(fā)性干燥綜合征中的抗SSA和SSB抗體（陽性率為70%和40%）、疾病非特異性自身抗體如抗核抗體，可出現(xiàn)在多種自身免疫疾病中[6]。

2 自免試劑盒國內(nèi)已上市產(chǎn)品情況

截止目前從藥監(jiān)局官網(wǎng)上可以查詢已上市的自身免疫性疾病檢測試劑盒就超過400個，由于此類產(chǎn)品的臨床意義越來越明確，相應(yīng)的市場需求也在逐年增加，臨床常規(guī)自身抗體檢測項(xiàng)目已達(dá)百種以上。在已上市產(chǎn)品中，有些是以某類抗體（譜）來命名產(chǎn)品，有些是以與某種疾病相關(guān)的抗體（譜）作為一個注冊單元進(jìn)行申請，不管以哪種形式來命名產(chǎn)品，最終是以產(chǎn)品的預(yù)期用途為命名依據(jù)。由于自免診斷產(chǎn)品的技術(shù)門檻相對較高，國內(nèi)自免市場上主要仍然以進(jìn)口產(chǎn)品為主，如歐蒙、胡曼等，隨著對自免疾病的認(rèn)識加深和政策的扶持，國內(nèi)越來越多企業(yè)開始加入進(jìn)來。

自身抗體的常用檢測方法主要為間接免疫熒光法、免疫印跡法、酶聯(lián)免疫法及化學(xué)發(fā)光法等基于抗原抗體定性、半定量、定量檢測。這其中免疫熒光技術(shù)因其具有對自身抗體檢測全面，具有能檢測未知或難以純化靶抗原的自身抗體、可發(fā)現(xiàn)新抗體等優(yōu)勢，目前是自身抗體檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[6]，但缺點(diǎn)是檢測結(jié)果的判斷需要實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，有些組織切片的熒光模型（核型）難以分辨，確定滴度的工作量大。因此其他方法學(xué)的出現(xiàn)對于傳統(tǒng)方法作為一個補(bǔ)充，極大地豐富了臨床檢測手段，如酶聯(lián)免疫吸附法可對自身抗體進(jìn)行定量或定性檢測，具有高敏感性，可以用于篩查，也可用于確認(rèn)，但需對每個自身抗體進(jìn)行逐項(xiàng)檢測，且批內(nèi)批間差較大，檢測線性范圍窄，精密度不高，操作過程復(fù)雜，易受洗板過程以及酶的穩(wěn)定性的影響。檢測的陽性結(jié)果可用滴度或稀釋度表示，但有可能檢測到?jīng)]有臨床意義的低親和力抗體[7]。免疫印跡法靈敏度高、特異性強(qiáng)、批間差小，不需要特殊設(shè)備，且易操作，一次實(shí)驗(yàn)可同時檢測多種自身抗體，但膜條上的抗原種類非常有限，其檢測結(jié)果也多為定性或半定量檢測。化學(xué)發(fā)光免疫分析法具有高敏感性、特異定量及自動化的優(yōu)點(diǎn)。每種方法有自己的優(yōu)缺點(diǎn)和局限性，在臨床使用上側(cè)重點(diǎn)不同，因此產(chǎn)品在設(shè)計(jì)開發(fā)時的側(cè)重點(diǎn)與關(guān)注點(diǎn)也會不同，下面將對申報(bào)產(chǎn)品存在的問題及改進(jìn)建議進(jìn)行說明。

3 存在問題

自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，影響因素多。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及實(shí)際臨床經(jīng)驗(yàn)，健康人群中也存在一定的自身抗體陽性檢出率，檢出時間與發(fā)病時間不同步等[7-8]。這在一定程度上對驗(yàn)證試劑檢測的準(zhǔn)確與否帶來了判斷困難。另一方面，任何試劑都不可避免有一定概率的假陽性，還存在灰區(qū)風(fēng)險，且目前檢測試劑盒運(yùn)用的方法學(xué)種類多，產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，不同產(chǎn)品檢測結(jié)果橫向比較困難。具體主要體現(xiàn)在以下方面。

3.1 臨床診斷的局限性

自身免疫性疾病是指機(jī)體對自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病，隨著醫(yī)學(xué)的研究，許多疾病相繼被列為自身免疫性疾病，而自身抗體也可以存在于正常人體內(nèi)，因此自身抗體的存在不能等同于自身免疫性疾病。且很多情況下抗體檢測時間早于疾病發(fā)病時間，這也使臨床診斷更加復(fù)雜和困難。目前，針對自身抗體的檢測國內(nèi)采用定性方法較多，如免疫印跡法、酶免法。定性方法的優(yōu)勢主要用在鑒別、初篩，容易出現(xiàn)假陽性，灰區(qū)也有主觀性。定量產(chǎn)品可以用于對疾病的活躍程度、疾病進(jìn)程的觀察及治療效果監(jiān)測具有更好的參考意義，但由于目前自身抗體的檢測尚未實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，不同產(chǎn)品的溯源鏈不同，檢測結(jié)果差別大，造成結(jié)果無法實(shí)現(xiàn)互認(rèn)。

3.2 試劑盒的質(zhì)量

自身免疫性疾病檢測試劑盒作為目前自身抗體檢測的重要技術(shù)工具，其本身的質(zhì)量直接決定了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而可以影響醫(yī)生對疾病的診斷和處置。試劑盒質(zhì)量和檢測能力受很多因素影響。一是抗原選擇；不同廠家的檢測試劑采用的抗原不同（如抗原特性、分布、含量等），而不同來源的抗原與自身抗體的結(jié)合能力不同，抗原所包含的片段及其構(gòu)象可能有所不同，針對不同的抗原靶位。二是參考標(biāo)準(zhǔn)：多數(shù)自身抗體沒有公認(rèn)的參考物質(zhì)及參考測量程序，大多無法溯源；缺少合適的商業(yè)化質(zhì)控品，企業(yè)采用的質(zhì)控品多為企業(yè)自制；多數(shù)自免類產(chǎn)品沒有轉(zhuǎn)化血清盤，很多企業(yè)自己制定內(nèi)部參考品評估陽性符合率和陰性符合率。因此定性產(chǎn)品還有一個值得注意的地方是參考樣品（比如陽性參考品、陰性參考品）的設(shè)置。根據(jù)不同的檢測項(xiàng)目的實(shí)際情況以及產(chǎn)品的預(yù)期用途確定參考品。參考樣品應(yīng)該能體現(xiàn)產(chǎn)品在cut-off值的檢測能力。三是參考值/區(qū)間設(shè)置：不同廠家的檢測試劑對檢測結(jié)果的cut-off值設(shè)定、參考區(qū)間及檢測范圍的不一致。四是檢測指標(biāo)的兼容性：試劑生產(chǎn)企業(yè)從市場利益出發(fā)，隨意進(jìn)行多個檢測項(xiàng)目組合自身抗體檢測，未針對某一疾病特異性抗體譜或相關(guān)抗體進(jìn)行設(shè)計(jì)，由于包被不同特性的靶抗原在同一反應(yīng)體系中檢測多種自身抗體，彼此結(jié)果未有協(xié)同作用，反而造成互相干擾，導(dǎo)致了臨床診斷效能下降[9]。

4 建議

4.1 靈敏度與特異性

《抗核抗體檢測的臨床應(yīng)用專家共識2018》以及臨床經(jīng)驗(yàn)表明，健康人群中的抗核抗體譜也會有一定的陽性檢出率，且同一種抗體在不同自身免疫疾病中的陽性檢出率不同，如ANA在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的陽性率為80%～100%，而在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的陽性率僅為20%～40%，有些抗體正常人也會有一定程度的陽性檢出率，及所謂的假陽性。因此企業(yè)在產(chǎn)品設(shè)計(jì)開發(fā)時，應(yīng)結(jié)合臨床實(shí)際情況和產(chǎn)品預(yù)期用途（用于初步篩查或確診），綜合考慮產(chǎn)品的靈敏度和特異性，有針對性地進(jìn)行開發(fā)設(shè)計(jì)。一般來說，用于篩查的產(chǎn)品對靈敏度要求較高，用于確診的產(chǎn)品的對特異性要求較高。

4.2 原材料的選擇與制備

自免類產(chǎn)品原材料選擇是決定產(chǎn)品性能的關(guān)鍵因素，一般涉及的抗原種類較多，無論是企業(yè)自制還是外購，都應(yīng)對抗原的制備與純化過程進(jìn)行詳細(xì)說明，如抗原的序列選擇、克隆表達(dá)過程及抗原的鑒定、純化。例如Jo-1蛋白采用的是基因編碼的完整的氨基酸序列，與只選擇部分氨基酸序列作為抗原相比，前者的免疫原性和抗原表位最完整，最接近天然構(gòu)象，能夠最大程度地識別體內(nèi)自免抗體。因此蛋白編碼序列的選擇直接關(guān)乎到抗原表位的識別。

4.3 參考品的制備

自身免疫類產(chǎn)品目前不同廠家的檢測結(jié)果可比性差的最重要原因是沒有公認(rèn)的參考物質(zhì)及參考測量程序，對于定量產(chǎn)品，溯源途徑不同，甚至無法溯源。目前只有少數(shù)項(xiàng)目有國際參考物質(zhì)，比如dsDNA（WHO參考物質(zhì)，Wo/80）、GAD65（WHO參考物質(zhì)，97/550）、IA2（WHO參考物質(zhì)，97/550），對于有國際參考物質(zhì)的項(xiàng)目應(yīng)盡可能溯源至國際參考物質(zhì)，沒有國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或國際參考物質(zhì)的項(xiàng)目，企業(yè)應(yīng)該建立自己的穩(wěn)定的溯源鏈，可選擇目前市場上口碑較好的試劑作為溯源。對于定性產(chǎn)品，應(yīng)建立自己的血清參考盤，設(shè)置陽性參考品時應(yīng)考慮多個滴度，這對于評價不同陽性樣本的檢出率及符合率很重要，設(shè)置陰性樣本時也應(yīng)考慮樣本的不同來源，還應(yīng)包含與申報(bào)產(chǎn)品檢測項(xiàng)目不同的其他自免疾病類的陰性血清。

4.4 參考值的建立

自身免疫疾病發(fā)病相對比較隱匿，所以在很長時間內(nèi)可以無癥狀或者癥狀不典型，進(jìn)而出現(xiàn)較高的臨床漏診率，但是患病早期已經(jīng)能夠檢測到自身抗體的存在，因此，自身抗體篩查就顯得非常重要。如果產(chǎn)品的預(yù)期用途為篩查患者，那么產(chǎn)品的敏感性高應(yīng)作為企業(yè)研發(fā)時首選因素，并對假陽性的情況加以甄別。由于不同的自身抗體在不同疾病中的敏感性及特異性有所不同，同一個疾病相關(guān)抗體中，每種抗體的敏感性和特異性不同，或同一個抗體在不同疾病中表現(xiàn)出的敏感性和特異性也會不同。因此，不管是定性產(chǎn)品還是定量產(chǎn)品，試劑生產(chǎn)商應(yīng)重視參考值的研究，并且充分考慮產(chǎn)品的預(yù)期用途。通過查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，明確自身抗體在自身免疫性疾病中的流行病學(xué)研究進(jìn)展，自身抗體在性別、年齡、種族、甚至地緣性之間有顯著差異[10]。國內(nèi)廠家往往在開展自免類項(xiàng)目時，直接采用進(jìn)口產(chǎn)品的參考值進(jìn)行不充分的驗(yàn)證，可能導(dǎo)致采用的參考區(qū)間與臨床實(shí)際不符，給將來的臨床判斷帶來困難和不確定性。而定性產(chǎn)品更應(yīng)該根據(jù)產(chǎn)品的預(yù)期用途（比如診斷目的、目標(biāo)人群、靈敏度和特異性的要求等），設(shè)置合理的cut-off值，應(yīng)重視cut-off值附近濃度的臨床樣本的驗(yàn)證，并對灰區(qū)的設(shè)置進(jìn)行研究。

4.5 臨床評價

近年來，越來越多的新抗體被證實(shí)在自身免疫疾病的診斷和檢測中有潛在的臨床意義，如果申請的抗體不在免臨床目錄中，應(yīng)提供臨床試驗(yàn)資料，證明產(chǎn)品的臨床性能，包括臨床決策點(diǎn)。選擇比對方法時，應(yīng)以間接免疫熒光法（IIF）作為比對方法，提交相關(guān)臨床研究數(shù)據(jù)，這些研究旨在支持被測物對目標(biāo)人群適用，以及評估目標(biāo)人群中的抗體陽性率來驗(yàn)證臨床靈敏度。同時建議測試來自其他免疫疾病、感染性疾病以及與性別、年齡相匹配的正常受試者血清樣本中的抗體，來驗(yàn)證臨床特異性。多數(shù)自身免疫性疾病都伴有特征性的自身抗體譜，在進(jìn)行樣本入組時，也應(yīng)考慮每項(xiàng)檢測指標(biāo)都應(yīng)符合一定例數(shù)。如是定性產(chǎn)品，常用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法包括陰陽性符合率、卡方檢驗(yàn)及Kappa一致性等，如是定量產(chǎn)品，一般進(jìn)行Bland-Altman分析及偏倚分析，另外醫(yī)學(xué)決定水平處的預(yù)期偏倚及其可信區(qū)間也是應(yīng)該關(guān)注的內(nèi)容。