李廷剛，陳廣霞，張倩倩，鞏東營

（1. 山東省葡萄研究院，山東濟南 250100；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東濟南 250100）

灰葡萄孢（Botrytis cinerea）屬于半知菌類（Fungi imperfecti），絲孢綱（Hyphomycetes），絲孢目（Moniliales），淡色孢科（Moniliaceae），葡萄孢屬（Botrytis）[1]，其侵染寄主后可引起灰霉病?；移咸焰呒闹鞣秶謴V泛，幾乎所有的雙子葉植物，包括作物、水果、蔬菜和花卉等都可侵染。此外，灰葡萄孢可侵染寄主花、果、葉、莖等多個地上組織，造成寄主多處同時發(fā)病，因此防治極為困難?；颐共橐环N世界性病害，在我國多個省份危害嚴重，重病區(qū)損失可達到40%～50%，甚至絕產(chǎn)[2-3]。

由于葡萄中抗灰霉病種質(zhì)資源匱乏，加之灰葡萄孢繁殖速率快、變異頻率高、適應(yīng)性強，目前葡萄灰霉病的防治依然艱巨[4]。葡萄灰霉病是一種典型的氣傳病害，可隨空氣、水流以及農(nóng)事作業(yè)傳播，分生孢子在病害侵染循環(huán)和流行中起著關(guān)鍵性的作用。短期內(nèi)能否產(chǎn)生大量的分生孢子是灰霉病能否流行的重要因素之一[5]，如何有效抑制灰葡萄孢分生孢子的形成將成為灰霉病防治的有效途徑。因此，對灰葡萄孢生長和分生孢子產(chǎn)生條件進行系統(tǒng)的研究，可為葡萄灰霉病的防治提供依據(jù)。

以葡萄灰葡萄孢SYT3-7菌株為研究材料，探索不同培養(yǎng)基、溫度、光照等對菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響。旨在優(yōu)化葡萄灰葡萄孢的生長和產(chǎn)孢條件，為開展葡萄灰葡萄孢遺傳轉(zhuǎn)化等需要大量分生孢子的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山東省煙臺地區(qū)葡萄園中采集有典型癥狀的病果，按照董娟華等[5]方法進行菌株分離，獲得單孢SYT3-7。經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定和5.8S rDNA-ITS區(qū)序列分析，確定其為灰葡萄孢[7-8]，并保存于山東省葡萄研究院。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

選擇8種真菌常用培養(yǎng)基（配方見表1）。取培養(yǎng)3 d的菌落，用打孔器沿菌落邊緣取直徑5 mm菌餅，移入培養(yǎng)基平板中央，每皿1塊，于23 ℃下黑暗培養(yǎng)，每個處理3皿，重復(fù)3次[9-11]。采用十字交叉法測量菌落直徑，每12 h測量1次，并觀察菌落生長狀況。靜置培養(yǎng)7 d后，用10 mL無菌蒸餾水從培養(yǎng)皿上洗脫分生孢子，用血球計數(shù)法測量分生孢子產(chǎn)生濃度[12]（下同）。

1.2.2 溫度對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

取菌餅接入PDA和MSM平板中央，分別置于5、10、15、20、23、25、28、30、35 ℃的溫度條件下黑暗培養(yǎng)，每個處理接3個皿，重復(fù)3次，其中PDA培養(yǎng)基用于灰葡萄孢生長速率的測定，MSM培養(yǎng)基用于灰葡萄孢產(chǎn)孢量的測定。

1.2.3 pH對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

用0.1 mo1/L的NaOH或HCl將PDA培養(yǎng)基和MSM培養(yǎng)基pH值分別調(diào)節(jié)到3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0九個梯度后高壓蒸汽滅菌。取菌餅分別接入PDA培養(yǎng)基和MSM培養(yǎng)基平板中央，23 ℃下黑暗培養(yǎng)，每個處理接3個皿，重復(fù)3次。其中PDA培養(yǎng)基用于灰葡萄孢生長速率的測定，MSM培養(yǎng)基用于灰葡萄孢產(chǎn)孢量的測定。

表1 8種培養(yǎng)基成分組成Table 1 Composition of 8 kinds of culture medium

1.2.4 光照條件對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

取菌餅接入PDA和MSM培養(yǎng)基平板中央，每種培養(yǎng)基分為8組，于23 ℃下分別置于：持續(xù)黑暗、持續(xù)光照、12 h光照/12 h黑暗、自然光，培養(yǎng)12 h后置于紫外線環(huán)境照射2 h后持續(xù)黑暗、持續(xù)光照、12 h光照/12 h黑暗、自然光8種光照條件下進行培養(yǎng)。每個處理接3個皿，重復(fù)3次，其中PDA培養(yǎng)基用于灰葡萄孢生長速率的測定，MSM培養(yǎng)基用于灰葡萄孢產(chǎn)孢量的測定。

1.2.5 碳源對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

所用基本培養(yǎng)基為CZA培養(yǎng)基，配方見表1。分別以相同質(zhì)量碳素的麥芽糖、乳糖、果糖、可溶性淀粉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、半乳糖代替基本培養(yǎng)基中的蔗糖，配成不同碳源的培養(yǎng)基，并以不加碳素的基本培養(yǎng)基作為對照。取菌餅接入各培養(yǎng)基平板中央，23 ℃下黑暗培養(yǎng)，每個處理接3個皿，重復(fù)3次，測量菌落直徑和產(chǎn)孢量。

1.2.6 氮源對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

所用基本培養(yǎng)基為CZA培養(yǎng)基，配方見表1。分別以相同質(zhì)量氮素的硝酸鉀、硫酸銨、硝酸銨、尿素、蛋白胨、苯丙氨酸、精氨酸、甘氨酸替代基本培養(yǎng)基中的硝酸鈉，配成不同氮源的培養(yǎng)基，并以不加氮素的基本培養(yǎng)基作為對照。取菌餅接入各培養(yǎng)基平板中央，23 ℃下黑暗培養(yǎng)，每個處理接3個皿，重復(fù)3次，測量菌落直徑和產(chǎn)孢量。

1.2.7 病原菌菌絲及分生孢子致死溫度和時間測定

取無菌試管36支，每6支一組，向每支中加入適量無菌水，并投入6塊直徑5 mm的菌餅。然后將每組試管對應(yīng)置于35、40、45 、50、55、60 ℃恒溫水浴鍋中，分別處理5、10、15、20、25、30 min，水浴鍋水面要高于無菌水液面。取出試管后迅速冷卻至室溫，將菌餅取出接種在PDA培養(yǎng)基平板中央，每皿接一塊，每處理重復(fù)6皿，23 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察菌絲生長情況。

取無菌試管36支，6支一組，將孢子懸浮液稀釋至一定濃度后加入試管中，將每組試管分別置于35、40、45、50、55、60 ℃恒溫水浴鍋中，分別處理5、10、15、20、25、30 min，水浴鍋水面要高于孢子懸浮液。取出試管迅速冷卻至室溫，各吸取1滴孢子懸液于載玻片上，每處理重復(fù)6次，23 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，觀察分生孢子的萌發(fā)情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用微軟Excel 2016和SPSS Statistics 25.0數(shù)據(jù)處理軟件對所得數(shù)據(jù)進行整理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對灰葡萄孢菌絲生長及產(chǎn)孢量影響

結(jié)果顯示，灰葡萄孢在PDA培養(yǎng)基上生長速率最快，其次為PSA和MSM培養(yǎng)基，而在ATCC培養(yǎng)基上生長最為緩慢，僅為0.88 cm/d（表2）。7 d后對產(chǎn)孢量的統(tǒng)計結(jié)果顯示，在MSM培養(yǎng)基上產(chǎn)孢最多，達到57.00×105cfu/mL，與其他培養(yǎng)基存在顯著差異（表2）。由此可見，PDA培養(yǎng)基較為適合該病原菌的生長，MSM培養(yǎng)基適合病原菌產(chǎn)孢。因此，在后續(xù)試驗中對于灰葡萄孢生長速率的測定采用PDA培養(yǎng)基，對產(chǎn)孢量的測定在MSM培養(yǎng)基中進行。

2.2 溫度對灰葡萄孢菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

不同溫度對灰葡萄孢菌絲生長及產(chǎn)孢量統(tǒng)計結(jié)果（表3）顯示，PDA培養(yǎng)基上灰葡萄孢在35 ℃以上不能生長，菌絲生長的溫度范圍是5～30 ℃，最適溫度25 ℃；分生孢子產(chǎn)生的適宜溫度范圍也為5～30 ℃，最適溫度23 ℃。

2.3 培養(yǎng)基pH對灰葡萄孢菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

培養(yǎng)基不同pH對灰葡萄孢菌絲生長及產(chǎn)孢量統(tǒng)計結(jié)果（表4）顯示，灰葡萄孢能適應(yīng)較寬的pH范圍，在pH 3～11的范圍內(nèi)均可以生長和產(chǎn)孢。最適宜菌絲生長和分生孢子產(chǎn)生的酸堿度均是pH6；pH5與pH6處理的菌絲生長速率差異不顯著，說明灰葡萄孢在偏酸性條件下生長活性較好。

表2 培養(yǎng)基對灰葡萄孢菌絲生長及產(chǎn)孢量統(tǒng)計Table 2 Statistics on the hyphae growth and conidia production of Botrytis cinerea in different media

2.4 光照條件對灰葡萄孢菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

不同光照條件對灰葡萄孢菌絲生長及產(chǎn)孢量統(tǒng)計結(jié)果（表5）顯示，各光照條件對葡萄灰葡萄孢生長速率影響不大，在0.01水平上差異不顯著，其中以在自然光條件下生長速率最快。然而，多種光照組合條件下，灰葡萄孢的產(chǎn)孢量卻存在一定差異，其中以紫外處理后自然光照培養(yǎng)下產(chǎn)孢量最多。

2.5 碳源對灰葡萄孢菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

不同碳源對灰葡萄孢菌絲生長及產(chǎn)孢量統(tǒng)計結(jié)果（表6）顯示，灰葡萄孢在供試的8種碳源環(huán)境下均可生長，但在以葡萄糖為碳源的菌絲生長最快，在以山梨醇為碳源條件下生長最為緩慢。但產(chǎn)孢卻以乳糖為最優(yōu)碳源。在以山梨醇和甘露醇為碳源的菌絲雖然可以生長但并不產(chǎn)生分生孢子。另外，碳源缺乏環(huán)境下菌絲幾乎不生長，也幾乎不產(chǎn)生分生孢子。

2.6 氮源對灰葡萄孢菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

不同氮源對灰葡萄孢菌絲生長及產(chǎn)孢量統(tǒng)計結(jié)果（表7）顯示，灰葡萄孢在8種氮源環(huán)境下均可生長。在以蛋白胨為氮源時不僅菌絲生長最快，產(chǎn)孢量也最大。在以尿素和甘氨酸為氮源的條件下生長較為緩慢，甚至低于不含氮源的培養(yǎng)條件。在產(chǎn)孢量方面，以 (NH4)2SO4為氮源時產(chǎn)孢量最少，但仍高于不含氮源的條件。

表3 溫度對灰葡萄孢菌絲生長及產(chǎn)孢量統(tǒng)計Table 3 Statistics on the hyphae growth and conidia production of Botrytis cinerea under different temperatures

表4 培養(yǎng)基pH對灰葡萄孢菌絲生長及產(chǎn)孢量統(tǒng)計Table 4 Statistics on the hyphae growth and conidia production of Botrytis cinerea under different pH

表 5 光照條件對灰葡萄孢菌絲生長及產(chǎn)孢量統(tǒng)計Table 5 Statistics on the hyphae growth and conidia production of Botrytis cinerea in different light conditions

表 6 碳源對灰葡萄孢菌絲生長及產(chǎn)孢量統(tǒng)計Table 6 Statistics on the hyphae growth and conidia production of Botrytis cinerea in different carbon sources

2.7 灰葡萄孢菌絲及分生孢子致死溫度和時間測定

將灰葡萄孢分生孢子在45 ℃水浴中處理30 min、50 ℃水浴中10 min之后，以及在55、60 ℃的水浴中，分生孢子均不能萌發(fā)，表明灰葡萄孢分生孢子的致死溫度和處理時間為45 ℃、30 min或50 ℃、10 min。將灰葡萄孢菌絲在經(jīng)50 ℃處理時間25 min、55 ℃處理時間10 min以及60 ℃處理時間5 min以上的條件下菌絲均不能再繼續(xù)生長，表明灰葡萄孢菌絲的致死溫度和時間分別為50 ℃處理25 min或55 ℃處理10 min（表8）。

3 討論與結(jié)論

試驗結(jié)果表明，葡萄灰葡萄孢菌絲最佳生長條件為：PDA培養(yǎng)基、pH6、25 ℃、自然光照下培養(yǎng)，碳源以葡萄糖為最佳，氮源以蛋白胨為最佳。該結(jié)果與任亞峰[8]一致，與白曉蒙等[13]的研究結(jié)果基本一致。任亞峰[8]認為，貴州地區(qū)葡萄灰葡萄孢菌絲生長的最佳碳源為葡萄糖，而白曉蒙認為菌絲生長的最佳碳源為蔗糖。本研究葡萄灰葡萄孢最佳產(chǎn)孢條件為：MSM培養(yǎng)基、pH6、23 ℃、經(jīng)紫外照射后自然光培養(yǎng)，碳源以乳糖為最佳，氮源以蛋白胨為最佳。該結(jié)果與崔志峰等[14]的結(jié)果在pH、溫度、碳氮源等方面基本一致。病原菌菌絲的致死溫度為50 ℃處理25 min或55 ℃處理10 min；而分生孢子的致死溫度則為45 ℃處理30 min或50 ℃處理10 min，說明灰葡萄孢菌絲對高溫的耐受力明顯高于分生孢子，這或許是因為在不良環(huán)境條件下，菌絲中個別細胞膨大可形成細胞厚增壁、原生質(zhì)濃縮的厚垣孢子，從而抵御不良環(huán)境條件[12]。

研究還發(fā)現(xiàn)，在對培養(yǎng)基進行篩選時菌絲生長以PDA培養(yǎng)基為宜而產(chǎn)孢卻以MSM培養(yǎng)基最佳，且與PDA培養(yǎng)基存在顯著差異，推測葡萄灰葡萄孢分生孢子的產(chǎn)生存在一定的物種特異性，需要有特異性的誘導(dǎo)物質(zhì)存在。目前，在葡萄灰葡萄孢研究中還未見系統(tǒng)報道，但與段亞冰等[15]對Pilidium concavum的研究結(jié)果相一致。另外，經(jīng)比較分析還發(fā)現(xiàn)，相同的光照條件經(jīng)紫外照射后，生長速率普遍低于未經(jīng)紫外照射的菌株；相反，相同的光照條件下經(jīng)紫外照射后，產(chǎn)孢量均略高于未經(jīng)紫外處理的菌株。說明紫外處理對菌株菌絲的生長具有一定的抑制作用，然而卻更有利于分生孢子的產(chǎn)生[16]。在氮源的利用方面，添加某些氮源，如尿素和甘氨酸，與未加任何氮源相比，菌絲的生長速率緩慢，但究竟其如何抑制病原菌菌絲的生長，仍需進一步研究。而在產(chǎn)孢方面卻是以不加氮源的對照組為最少，說明氮源對于病原菌的產(chǎn)孢是必不可少的[13]。在培養(yǎng)基pH3～11、溫度10～30 ℃范圍內(nèi)灰葡萄孢均可生長和產(chǎn)孢，另外光照對于灰葡萄孢生長和產(chǎn)孢的影響總體來說并不明顯，說明灰葡萄孢對環(huán)境的適應(yīng)性較強，這也恰好與灰霉病寄主范圍廣、繁殖速度快、流行性廣等特點相吻合[17]。

表 7 氮源對灰葡萄孢菌絲生長及產(chǎn)孢量統(tǒng)計Table 7 Statistics on the hyphae growth and conidia production of Botrytis cinerea in different nitrogen sources

表 8 灰葡萄孢菌絲及分生孢子致死溫度的測定Table 8 Determination of the lethal temperature of Botrytis cinerea hyphae and conidia

對葡萄灰葡萄孢生長與產(chǎn)孢條件進行探索，不僅有利于認識葡萄灰葡萄孢的生物學(xué)特性和發(fā)生特點，而且在其與土壤碳、氮等養(yǎng)分利用關(guān)系研究方面有重要意義[18]。另外，20世紀90年代Hamada等[19]首次發(fā)表灰葡萄孢病菌轉(zhuǎn)化技術(shù)，為開展灰葡萄孢分子生物學(xué)研究提供了重要的指導(dǎo)。但為了更好的開展灰葡萄孢分子生物學(xué)研究，建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化方法，需要獲得足夠的分生孢子，研究對高毒力葡萄灰葡萄孢菌株SYT3-7的生長及產(chǎn)孢條件進行了優(yōu)化，可以較好的滿足開展灰葡萄孢基因功能研究時對孢子數(shù)量的要求。該試驗僅對分離自山東煙臺地區(qū)葡萄灰葡萄孢菌株的生長及產(chǎn)孢條件進行探索，然而不同地理來源、不同寄主的同種真菌生物學(xué)特性方面仍會存在一定差異[20]。因此，未來有必要對不同地理來源或寄主的灰葡萄孢菌株生長與產(chǎn)孢條件進行系統(tǒng)研究。