方 超，張智明，李建華，何世岷

（哈藥集團 生物疫苗有限公司，哈爾濱150069）

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病毒（PRV）引起的一種大多數(shù)哺乳動物及一些禽類的急性、烈性、高度接觸性傳染病，是一種能感染神經(jīng)系統(tǒng)的疾。動物感染后出現(xiàn)發(fā)熱、瘙癢等神經(jīng)癥狀、腦脊髓炎或死亡等臨床癥狀。PR是影響全球豬養(yǎng)殖業(yè)的主要的傳染病之一，給世界各國養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟損失十分巨大。因此，世界各國對此病十分重視，并開啟和實施了根除PR的計劃，且取得了階段性的勝利[1-5]。但自2010年起，PRV出現(xiàn)新的變異株，使PR在全球尤其是我國出現(xiàn)新一輪的暴發(fā)，有很多PRV變異毒株被分離和鑒定[6-9]。黑龍江省是一個養(yǎng)豬大省，部分地區(qū)也存在PR的流行，因此，在黑龍江省進行PRV的分離與鑒定，有助于了解病毒的流行情況，并為偽狂犬病的防控提供幫助[10]。

本研究對經(jīng)過鑒定、純化的PRV現(xiàn)地分離株進行繼代培養(yǎng)，與經(jīng)典PRV Ra株對比繪制病毒生長曲線，以確定其最佳培養(yǎng)時間，并檢測該分離株對不同動物的致病力，以期為后續(xù)試驗的順利開展做好鋪墊。

1 材料

1.1 樣品

已純化的PRV現(xiàn)地分離株，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所惠贈；經(jīng)典PRV Ra株，購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，由哈藥集團生物疫苗有限公司研發(fā)中心傳代保存。

1.2 細胞及主要試劑

F16代Vero傳代細胞系，由哈藥集團生物疫苗有限公司研發(fā)中心保存；DMEM F12培養(yǎng)基，含0.25% EDTA胰酶，購自GIBCO公司；胎牛血清，購自CLARK公司；PBS溶液，由哈藥集團生物疫苗有限公司研發(fā)中心配制；DNA/RNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；PRV引物，生工生物工程（上海）有限公司合成；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 試驗動物

體重1.5～2.0 kg家兔4只，由東北農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心提供；體重18～22 g小白鼠10只，購自哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院；PRV血清中和抗體為陰性的4～6周齡斷奶仔豬3頭，購自哈爾濱周邊某豬場。

2 方法

2.1 細胞的復蘇

將液氮中保存的F16代Vero細胞取出1支，迅速放入準備好的37℃左右的溫水中并不斷晃動，使凍存的細胞快速解凍。待細胞完全解凍后，在1 000 r·min-1條件下離心5 min，棄上清液，用含有8%胎牛血清的DMEM F12細胞培養(yǎng)液輕輕懸浮并分散均勻，然后轉(zhuǎn)入T 25細胞瓶中。復蘇的細胞置37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細胞的生長情況，可于復蘇24 h左右進行1次換液處理，待細胞形成90%以上單層時進行傳代或接毒，用于病毒的分離培養(yǎng)。

2.2 病毒的分離培養(yǎng)

取形成單層的Vero細胞，棄去細胞培養(yǎng)液，用無菌的PBS液輕輕洗滌2次，將純化好的PRV現(xiàn)地分離株按照培養(yǎng)體積10%的比例接種于細胞單層上，接種完成后置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中吸附作用1 h，期間輕輕晃動2～3次，補加含有2%胎牛血清的DMEM F12細胞維持液后繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細胞病變情況。同時設條件相同的不接毒細胞作為空白對照。

接種后，當觀察到細胞病變達到80%以上時收獲，置-80℃冰箱反復凍融3次，按照上述方法進行傳代，直至出現(xiàn)穩(wěn)定的細胞病變；當觀察不到細胞病變時，在細胞培養(yǎng)后的4～5 d收獲，按照上述方法進行盲傳，盲傳3代后仍觀察不到病變，則判定此次病毒分離的結(jié)果為陰性。

2.3 病毒含量的測定

待Vero細胞形成單層后，按照1：3的傳代比例進行傳代，傳代后將細胞懸液按照每孔100μL的量加入96孔細胞培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48～72 h，待Vero細胞形成單層后，棄去培養(yǎng)板中的細胞培養(yǎng)液，備用。將收獲的病毒液用無血清DMEM F12培養(yǎng)液進行10倍倍比稀釋，取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-77個 稀 釋 度，接種到上述的96孔細胞培養(yǎng)板中，每個稀釋度接種6孔，每 孔100μL。同 時 設 正 常 細 胞 對 照6孔，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d，每天觀察細胞病變情況，按Reed-Muench法計算病毒的半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量（TCID50）。

2.4 病毒的鑒定

2.4.1 引物設計

按照《偽狂犬病診斷方法》（GB/T 18641—2018）中檢測PRV gD基因的引物序列合成引物，上游引物序列為5'-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3'，下游引物序列為5'-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3'，擴增片段長度217 bp。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

2.4.2 反應條件

將收獲的病毒液按天根生化科技(北京)有限公司的病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書的相關操作流程提取DNA，用2.4.1中的引物進行鑒定，PCR擴增反應體系（25μL）：2×GC Buffer 12.5μL，dNTP 2.0μL，上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，滅菌去離子水7.0μL，DNA模板1.0μL，Taq酶0.5μL。PCR擴增反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性30 s；56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次；72℃延伸10 min，4℃終止循環(huán)。

2.4.3 反應結(jié)果的觀察

將反應產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳后在凝膠成像系統(tǒng)下或紫外燈下進行PCR反應結(jié)果的觀察。

2.5 病毒生長曲線的繪制

將病毒以0.01 MOI的接種量接種于形成單層的Vero細胞12瓶，按照2.2的方法，在吸附1 h后，換加細胞維持液進行病毒培養(yǎng)。在病毒接種后，每隔6 h收獲1瓶接毒細胞，直至接毒的細胞全部收獲完畢。將上述收獲的細胞凍融3此后，按照2.3所述的方法進行各收獲時間病毒含量的測定并繪制病毒的一步生長曲線。

2.6 病毒的致病力試驗

2.6.1 對家兔的致病力試驗

取4只體重為1.5～2.0 kg的成年家兔，其中2只經(jīng)后腿肌肉接種分離的病毒液，2.0 mL·只-1，另外2只按相同的方式接種細胞維持液，2.0 mL·只-1。攻毒組和空白組在相同條件隔離飼養(yǎng)，逐日觀察并記錄家兔的發(fā)病和死亡情況。

2.6.2 對小白鼠的致病力試驗

取10只體重18～22 g小白鼠，隨機分成2組，每組5只。一組經(jīng)后退肌肉接種分離的病毒液，0.2 mL·只-1，另外一組按照相同的方式接種細胞維持液，0.2 mL·只-1。攻毒組和空白組在相同條件隔離飼養(yǎng)，逐日觀察并記錄小白鼠的發(fā)病和死亡情況。

2.6.3 對分離動物的致病力試驗

取3頭4周齡斷奶仔豬，隨機選擇其中2頭，分別經(jīng)滴鼻和肌肉注射的方式接種分離的病毒液4.0 mL，滴鼻和肌肉注射各2.0 mL，另外1頭仔豬按照肌肉注射的方式接種細胞維持液，4.0 mL·頭-1，攻毒組和空白組在相同條件下隔離飼養(yǎng)，逐日觀察并記錄斷奶仔豬的發(fā)病和死亡情況。

3 結(jié)果與分析

3.1 病毒的分離培養(yǎng)

將病毒接種于長滿單層的Vero細胞，接種后24 h細胞出現(xiàn)圓縮、膨大以及融合等PRV典型的細胞病變，隨著時間的增加，細胞病變也加重，在48 h的時候有超過80%的細胞病變并脫落，見圖1。此時終止培養(yǎng)并收獲培養(yǎng)液，反復凍融3次后進行傳代，結(jié)果細胞出現(xiàn)穩(wěn)定的細胞病變。表明分離得到一株病毒培養(yǎng)物（ZJS）。

3.2 病毒的鑒定

取收獲的病毒液，用核酸提取試劑盒進行核酸的提取和PCR鑒定，結(jié)果病料擴增出與PRV Ra株大小一致的片段，擴增結(jié)果見圖2。此結(jié)果也證明了分離獲得的病毒產(chǎn)物是PRV。

圖1 PRV分離結(jié)果（10×）

圖2 病料的PCR檢測結(jié)果

3.3 病毒的生長曲線

將病毒分離株和經(jīng)典Ra株分別以0.01 MOI的接種量接種到形成單層的Vero細胞上，在不同的時間取樣收獲病毒培養(yǎng)物，進行病毒含量的測定，結(jié)果見表1。由表1中數(shù)據(jù)可知，病毒分離株（ZJS）的繁殖速度較快，在接種后6 h時病毒含量即可達到100.5TCID50·mL-1，在42 h時病毒含量達到最高值108.17TCID50·mL-1，隨后達到平臺期，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)的病毒含量有所下降；Ra株的起始繁殖速度較分離株慢，在6 h仍然測不出病毒含量，隨后病毒開始增值，在48 h時病毒含量達到最高值，為107.25TCID50·mL-1，隨后達到平臺期，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)的病毒含量有所下降。按照測定的數(shù)據(jù)繪制分離株和Ra株的一步生長曲線，見圖3。

表1 不同培養(yǎng)時間的病毒含量測定結(jié)果

圖3 病毒的一步生長曲線

由圖3可知，分離株和Ra株的有著相似的生長特性，但分離株ZJS的最高病毒含量要高于Ra株的，病毒含量達到峰值的時間也較Ra株的時間短。

3.4 致病力試驗

3.4.1 對家兔的致病力

家兔接種PRV分離株后，每天觀察臨床癥狀。結(jié)果在接毒24 h后家兔開始發(fā)病，表現(xiàn)為精神比較興奮、厭食，接種部位有發(fā)癢的癥狀，家兔開始回頭舔咬，接毒48 h后家兔出現(xiàn)精神亢奮、狂躁不安、食欲基本廢絕，接種部位瘙癢加劇，家兔啃咬接種部位的頻率加快，即便接種部位的皮膚脫毛甚至出血也不能讓家兔啃咬的動作停下來，之后很快出現(xiàn)肌肉震顫等神經(jīng)癥狀，在接種48 h左右，2只接種兔子分別出現(xiàn)角弓反張、臥地不起癥狀，最后相繼死亡。而對照家兔在觀察期內(nèi)未見明顯的臨床癥狀變化，健康狀況良好。表明分離的PRV對家兔有較強的致病性。

3.4.2 對小白鼠的致病力

小鼠接種PRV分離株后，每天觀察臨床癥狀。結(jié)果在接毒24 h后沒有觀察到明顯的臨床癥狀，小鼠飲食、活動正常；在攻毒48 h后小鼠開始出現(xiàn)偽狂犬病比較典型的臨床癥狀，如多動、活躍、開始啃咬接種部位，食欲下降等；在攻毒72 h后有2只小鼠死亡，其余攻毒小鼠出現(xiàn)煩躁、亢奮、頻繁啃咬接種部位等癥狀；攻毒后84 h左右，攻毒小鼠全部死亡。未攻毒小鼠在觀察期內(nèi)未見明顯的臨床癥狀變化，健康狀況良好。表明分離的PRV對小鼠有較強的致病性。

3.4.3 對斷奶仔豬的致病力

斷奶仔豬接種PRV分離株后，每天觀察臨床癥狀，并對所有仔豬進行測溫。結(jié)果在接毒24 h后攻毒仔豬出現(xiàn)臨床癥狀，表現(xiàn)為精神萎靡、食欲不振，體溫升高等；攻毒48 h后表現(xiàn)為聚集、臥地不起、食欲廢絕、體溫升高以及呼吸加重等，有1頭豬出現(xiàn)腹瀉癥狀；攻毒后72 h時臨床癥狀進一步加重，出現(xiàn)腹式呼吸、肌肉震顫以及站立不穩(wěn)等癥狀；攻毒后96 h時有1頭仔豬死亡，另外1頭仔豬體溫降低、臥地不起，張口呼吸，在102 h時死亡。未攻毒仔豬在觀察期內(nèi)未見明顯的臨床癥狀變化，健康狀況良好。表明分離的PRV對仔豬有較強的致病性。

4 結(jié) 論

該現(xiàn)地分離株在細胞單層上分離培養(yǎng)效果良好，與PRV Ra株對比繪制的病毒生長曲線顯示，該分離株和Ra株有著相似的生長特性，但同一時間，分離株的最高病毒含量要高于Ra株，病毒含量達到峰值的時間的也較Ra株短。從不同動物致病力試驗結(jié)果可見，該分離株致病能力強。本研究為后續(xù)的疫苗制備篩選到一株優(yōu)良的備選毒株。