張惠喜，宋紅衛(wèi)，肖 猛，孫啟亮，袁國良

（菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 菏澤274000）

油用牡丹是我國新型的木本油料植物，2011年國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)牡丹籽油為新資源食品[1]。牡丹籽粕是壓榨牡丹籽油的副產(chǎn)物，在牡丹籽油制備過程中牡丹籽粕產(chǎn)出率為25%～30%[2]，每年大量用于榨油后的牡丹籽粕被廢棄，經(jīng)檢測牡丹籽粕中蛋白質(zhì)含量在30%左右，而且氨基酸種類全面，可以開發(fā)為一種蛋白質(zhì)飼料原料[3-4]。

研究表明，生物機(jī)體對蛋白質(zhì)的吸收并不全是以氨基酸形式，小分子多肽因具有重要的生理功效而被機(jī)體吸收利用[5]。通過水解蛋白質(zhì)可以得到易于機(jī)體消化吸收的小分子多肽，由于酸或堿水解法對蛋白質(zhì)破壞程度大，一般不用于制備蛋白質(zhì)水解產(chǎn)品[6]，而酶水解法作用條件溫和，能夠保持蛋白質(zhì)的活性，常常用于制備具有生物活性的多肽類產(chǎn)品[7]。

本試驗利用堿性蛋白酶水解牡丹籽粕制備蛋白質(zhì)多肽飼料產(chǎn)品，以期為牡丹籽粕在畜禽養(yǎng)殖上的利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 原料與試劑

牡丹籽粕，菏澤天寶牡丹有限公司產(chǎn)品；堿性蛋白酶（批號為S101054），上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；氫氧化鈉、鹽酸等，均分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

K9870型凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司產(chǎn)品；SHA-C型水浴恒溫振蕩器，天津賽得利斯實驗分析儀器制造廠產(chǎn)品；SK15型離心機(jī)，Sigma公司產(chǎn)品；FE20K型臺式酸度計，梅特勒-托利公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 牡丹籽粕多肽的提取工藝流程

按1：20（W/V）的料液比配制牡丹籽粕懸混液，用1.0 mol·L-1HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至設(shè)定值，加入設(shè)定比例的堿性蛋白酶，于水浴中恒溫酶解。在此期間不斷加入0.5 mol·L-1NaOH以保持溶液的pH不變，并記錄NaOH溶液的消耗量。反應(yīng)完成后，將酶解液于95℃沸水浴中滅活10 min，冷卻至室溫，再6 000 r·min-1離心10 min，過濾后即得牡丹籽粕酶解多肽。

2.2 牡丹籽粕蛋白水解度的測定

根據(jù)pH-state法[8]計算牡丹籽粕蛋白水解度（DH）。具體公式如下[9]：

式 中：C為NaOH溶 液 濃 度（mol·L-1），V為NaOH溶液消耗體積（mL），α為氨基的離解度；m為樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量（g），h為每克原料牡丹籽粕蛋白中肽鍵的毫摩爾數(shù)，h=7.84 mmol·g-1，T為試驗溫度（K）。

2.3 單因素試驗

2.3.1 溫度對牡丹籽粕蛋白酶解效果影響

按1：20（W/V）的料液比配制牡丹籽粕懸混液，用1.0 mol·L-1HCl或NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH=7.5，加入1.0%的堿性蛋白酶，分別在50℃、55℃、60℃、65℃水浴鍋中保溫酶解2.0 h，期間不斷加入0.5 mol·L-1的NaOH溶液以保持溶液的pH不變，記錄消耗的加堿量，分析酶解溫度對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響。

2.3.2 pH對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響

按1：20（W/V）的料液比配制牡丹籽粕懸混液，在60℃水浴鍋中保溫，加入1.0%的堿性蛋白酶，用1.0 mol·L-1HCl或NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH分別為6.5、7.0、7.5、8.0，酶解2.0 h，期間不斷加入0.5 mol·L-1NaOH以保持溶液的pH不變，記錄消耗的堿量，分析pH對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響。

2.3.3 酶濃度對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響

按1：20（W/V）的料液比配制牡丹籽粕懸混液，用1.0 mol·L-1HCl或NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH=7.5，并在60℃水浴鍋中保溫，分別加入濃度為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的堿性蛋白酶，酶解2.0 h，期間不斷加入0.5 mol·L-1NaOH以保持溶液的pH不變，記錄消耗的堿量，分析酶濃度對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響。

2.3.4 反應(yīng)時間對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響

按1：20（W/V）的料液比配制牡丹籽粕懸混液，用1.0 mol·L-1HCl或NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH=7.5，并在60℃水浴鍋中保溫，此時加入1.0%的堿性蛋白酶，分別酶解1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h，期間不斷加入0.5 mol·L-1NaOH以保持溶液的pH不變，記錄消耗的加堿量，分析反應(yīng)時間對牡丹籽粕蛋白酶解工藝的影響。

2.4 正交試驗確定最佳工藝條件

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，以水解度為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗，正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗

3.1.1 溫度對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響

溫度是影響蛋白酶解最重要的因素之一，過高或過低均會影響酶的活力，進(jìn)而影響酶解過程。當(dāng)溫度升高時，反應(yīng)速度也加快，另一方面，溫度過高也會使蛋白質(zhì)變性沉降，阻礙蛋白質(zhì)與酶的接觸，從而影響酶解效果[10]。本試驗中，隨著酶解溫度從50℃升高到60℃時，牡丹籽粕蛋白DH逐漸升高，從開始的10.02%增大到17.25%，當(dāng)酶解溫度超過60℃后，DH逐漸降低，酶解溫度從60℃升高到65℃時，牡丹籽粕蛋白DH從17.25%降低到14.36%，結(jié)果見圖1。

3.1.2 pH對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響

堿性蛋白酶的活性很大程度上取決于pH，因為pH能顯著影響堿性蛋白酶活性位點的氨基酸電離狀態(tài)，而且在維持酶的正常構(gòu)象方面起著重要作用[11-12]。本試驗中，隨著酶解液pH從6.5增加到7.5，牡丹籽粕蛋白的DH從8.08%增大到19.53%，當(dāng)pH值從7.5繼續(xù)增加到8.0時，牡丹籽粕蛋白DH從19.53%顯著降低到14.40%，結(jié)果見圖2。

圖1 不同酶解溫度下牡丹籽粕的蛋白酶解度

圖2 不同pH時牡丹籽粕的蛋白酶解度

3.1.3 酶濃度對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響

蛋白酶解時，底物濃度確定時，隨著酶濃度的增加，水解度隨著提高，當(dāng)酶濃度超過一定量時，DH趨于平緩。本試驗中，隨著酶濃度從0.6%增加到1.0%，牡丹籽粕蛋白DH從12.58%增加到17.84%，當(dāng)酶濃度從1.0%繼續(xù)增加到1.2%時，牡丹籽粕蛋白DH從17.84%變?yōu)?7.90%，結(jié)果見圖3。

圖3 不同酶濃度下牡丹籽粕蛋白的酶解度

3.1.4 反應(yīng)時間對牡丹籽粕蛋白酶解效果的影響

本試驗中，隨著反應(yīng)時間從1 h增大到3 h，牡丹籽粕蛋白DH從8.24%顯著地增加到15.86%，再繼續(xù)增加反應(yīng)時間，牡丹籽粕蛋白DH趨于平穩(wěn)，可能3 h的反應(yīng)時間已經(jīng)能夠確保底物與酶充分反應(yīng)，再繼續(xù)延長反應(yīng)時間，DH的變化幅度很小，結(jié)果見圖4。

圖4 不同反應(yīng)時間時牡丹籽粕的蛋白酶解度

3.2 正交試驗優(yōu)化酶解工藝

結(jié)果見表2和表3。

表2 正交試驗設(shè)計及牡丹籽粕蛋白DH測定結(jié)果

表3 牡丹籽粕蛋白DH方差分析結(jié)果

由表2、表3方差分析結(jié)果可知，溫度、pH、酶濃度對牡丹籽粕蛋白水解度的影響差異極顯著（P＜0.01），反應(yīng)時間對牡丹籽粕蛋白水解度的影響差異顯著（P＜0.05）；影響因素主次順序為pH＞酶解溫度＞酶濃度＞反應(yīng)時間。最佳酶解工藝組合為pH=7.5、酶解溫度60℃，酶濃度為1.2%，反應(yīng)時間為3 h。

4 結(jié) 論

牡丹籽粕是壓榨牡丹籽油的副產(chǎn)物，由于對牡丹籽粕的研究主要集中在其化學(xué)成分方面，因此大量榨油后的牡丹籽粕被廢棄。研究表明，在肉雞飼料中添加一定比例牡丹籽粕，能顯著提高21 d肉雞血漿IgG、IgM含量（P＜0.05）；在產(chǎn)蛋雞飼料中添加5%牡丹籽粕能夠提高蛋殼質(zhì)量、蛋黃等級、蛋白高度、哈氏單位[13]。牡丹籽粕蛋白質(zhì)含量為30%左右，且是一種營養(yǎng)健康安全的植物蛋白。小肽能夠促進(jìn)動物腸道系統(tǒng)的早期快速發(fā)育，對患有胃腸疾病動物的營養(yǎng)吸收、維護(hù)腸道健康、補(bǔ)充動物在快速生長期和高產(chǎn)期對氨基酸的需求具有重要意義[14]，將牡丹籽粕蛋白降解為更容易被吸收利用的小肽同時可解決適口性問題。本試驗借鑒大豆肽的生產(chǎn)工藝，采用堿性蛋白酶直接酶解牡丹籽粕蛋白，制備牡丹籽粕小肽飼料。通過單因素試驗和正交設(shè)計對影響牡丹籽粕蛋白酶解的因素進(jìn)行考察，獲得最佳工藝條件為：pH=7.5，酶解溫度為60℃，酶濃度為1.2%，反應(yīng)時間為3.0 h，牡丹籽粕蛋白水解度為17.18%。