鄧志士，劉佩佩，雷錦輝，劉師文，龔甜，熊英

（1.江西省高安市人民醫(yī)院，江西 高安 330800；2.江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330029）

腎綜合征出血熱（HFRS）是由漢坦病毒引起的一種在東亞特別是中國(guó)流行的鼠傳疾病[1]，全球病死率為1%～5%[2]。其發(fā)病機(jī)制可能是一個(gè)復(fù)雜的多因素過程，包括免疫反應(yīng)、血小板功能障礙和內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能失調(diào)[3]。發(fā)病早期采用有效的實(shí)驗(yàn)室診斷方法提高診斷率對(duì)提高HFRS患者治愈率，降低病死率，減輕疾病負(fù)擔(dān)非常重要[4]。

HFRS早期實(shí)驗(yàn)室診斷傳統(tǒng)方法為血清特異性IgM抗體檢測(cè)[5]，主要方法包括是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）和膠體金法。然而IgM抗體檢測(cè)在早期臨床標(biāo)本應(yīng)用中顯示出較高的假陰性率，易漏診[6-7]。用隨著病毒核酸檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，不同類型的實(shí)時(shí)熒光PCR法在漢坦病毒檢測(cè)方面應(yīng)用也有報(bào)道[8-10]，但是目前尚未見關(guān)于核酸檢測(cè)和IgM抗體檢測(cè)在HFRS早期病例診斷中的價(jià)值比較研究。

本研究對(duì)93例HFRS疑似病例急性期血清標(biāo)本進(jìn)行回顧性檢測(cè)分析，采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法檢測(cè)漢坦病毒核酸，采用ELISA和膠體法檢測(cè)漢坦病毒IgM抗體，比較核酸檢測(cè)和血清學(xué)IgM檢測(cè)在HFRS早期病例診斷中的價(jià)值，為HFRS早期診斷提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 收集高安市人民醫(yī)院2020年5月至2021年5月HFRS疑似病例急性期血清標(biāo)本（發(fā)病至采樣≤7 d）93例，凍存于-70℃以下冰箱。疑似病例符合流行性出血熱診斷標(biāo)準(zhǔn)定義（WS278-2008）。

1.2 試劑和儀器 漢坦病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒（北京萬泰）、核酸提取試劑（Qiagen）、核酸擴(kuò)增試劑（Thermo fisher Scientific）、核酸提取儀(Qiagen，96)、熒光定量PCR儀（ABI，7500型）、酶標(biāo)儀（安圖斯，anthous 2010）。

1.3 核酸檢測(cè) 采用核酸提取儀提取血清樣本核酸,采用雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)漢坦病毒核酸，具體參照文獻(xiàn)[11]，該法最低檢出限為10 copies/μl。

1.4 IgM抗體檢測(cè) 漢坦病毒IgM抗體檢測(cè)分別采用ELISA法和膠體金法，具體按照操作說明進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用WPS表格記錄數(shù)據(jù)，采用SPSS 22.0軟件按配對(duì)設(shè)計(jì)的卡方檢驗(yàn)分析（Mc-Nemanr檢驗(yàn)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并用Kappa系數(shù)分析檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 病例信息 高安市人民醫(yī)院是江西省HFRS監(jiān)測(cè)定點(diǎn)醫(yī)院。樣本和數(shù)據(jù)收集于高安市人民醫(yī)院傳染科病房，時(shí)間為2020年5月至2021年5月。按照《流行性出血熱診斷標(biāo)準(zhǔn)》，共收集到93例疑似HFRS病例，男性51例，女性42例，年齡6～89歲（平均46.95歲），發(fā)病到血清采集時(shí)間為0～7 d，中位數(shù)4 d。

2.2 核酸檢測(cè)結(jié)果 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法檢出漢坦病毒核酸陽性43例，陽性率46.24%，病毒型別均為漢灘型漢坦病毒。

2.3 IgM抗體結(jié)果 93份血清標(biāo)本中ELISA法和膠體金法分別檢出檢出IgM陽性33例、32例，陽性率分別為：35.48%、34.41%，見表1。經(jīng)配對(duì)設(shè)計(jì)的卡方檢驗(yàn)分析，兩種血清學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1＞0.05)，Kappa值為0.976。

表1 兩種血清學(xué)方法檢測(cè)IgM抗體符合率對(duì)比表

2.4 核酸檢測(cè)與抗體結(jié)果比較 核酸檢測(cè)與ELISA結(jié)果比較，見表2。ELISA法和核酸檢測(cè)法檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.002＜0.05)。Kappa值為0.780。兩種方法符合率89.25%（83/93）。以實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法為標(biāo)準(zhǔn)[12]，ELISA法靈敏度76.74%（33/43），特異度100%（50/50），陽性預(yù)測(cè)值100%（33/33），陰性預(yù)測(cè)值83.33%（50/60），準(zhǔn)確度89.25%（83/93）。

表2 核酸檢測(cè)與ELIS法結(jié)果對(duì)比表

核酸檢測(cè)與膠體金法結(jié)果比較，見表3。膠體金法與核酸檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001＜0.05），Kappa值為0.758。兩種方法符合率88.17%（82/93）。以實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法為標(biāo)準(zhǔn)[12]，膠體金法靈敏度74.41%（32/43），特異度100%（50/50），陽性預(yù)測(cè)值100%（32/32），陰性預(yù)測(cè)值81.97%（50/61），準(zhǔn)確度88.17%（82/93）。

表3 核酸檢測(cè)與膠體金法結(jié)果對(duì)比表

2.5 血清抗體IgM和病毒核酸檢出情況與發(fā)病后血清采集時(shí)間關(guān)系 ELISA結(jié)合膠體金法共檢出IgM抗體陽性33份，血清抗體IgM和病毒核酸檢出情況與發(fā)病后采集時(shí)間關(guān)系，見圖1。10例IgM抗體陰性病毒核酸陽性標(biāo)本中6份發(fā)病至采樣時(shí)間≦3 d，平均3 d。

圖1 血清IgM抗體和病毒核酸檢出情況與發(fā)病后血清采集時(shí)間比較圖

3 討論

HFRS的典型癥狀包括：發(fā)燒、頭痛、全身肌肉和腰痛等流感樣癥狀，以及厭食、惡心、嘔吐和腹瀉等胃腸道癥狀，最重要的是急性腎損傷。典型的HFRS分為五個(gè)階段：發(fā)熱、低血壓、少尿、多尿和恢復(fù)期[13]。典型癥狀臨床診斷難度不大，但是不典型HFRS病例非常多，尤其是兒童[14]，對(duì)非典型癥狀和體征往往難以診斷，甚至誤診。據(jù)報(bào)道，HFRS可誤診為結(jié)石性膽囊炎、急性胰腺炎、膽管炎、闌尾炎、胃腸道出血[15]。因此，早期、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)準(zhǔn)確判斷HFRS，及時(shí)開展有效治療，對(duì)降低危重比率和改善預(yù)后具有非常重要的意義[11]。

HFRS潛伏期4 d～45 d，多為7 d～14 d，多數(shù)患者在發(fā)病初期就可能產(chǎn)生特異IgM抗體，ELISA法檢測(cè)漢坦病毒特異性IgM曾被認(rèn)為是診斷急性漢坦病毒感染最有價(jià)值和最廣泛使用的方法。本研究結(jié)果顯示以熒光RT-PCR法為標(biāo)準(zhǔn)，ELISA法和膠體金法特異度均為100%，準(zhǔn)確度分別為89.25%、88.17%。93份樣本中膠體金法與ELISA法結(jié)果僅1例出現(xiàn)不一致，陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而膠體金法相對(duì)ELISA法操作更簡(jiǎn)單，時(shí)間更短，不需要特殊儀器設(shè)備，據(jù)此推薦膠體金法檢測(cè)IgM抗體進(jìn)行漢坦病毒感染快速篩查。

由于個(gè)體差異或檢測(cè)方法的局限，常見抗體檢出率低[6]，或患者首次IgM抗體陰性之后繼續(xù)采血檢測(cè)出現(xiàn)IgM陽性的報(bào)道[5,7]。馬有祥[16]研究報(bào)道IgM抗體檢測(cè)陽性率與病后血清采集時(shí)間有關(guān)系，在病人發(fā)病3 d以后IgM抗體檢測(cè)更具有實(shí)用價(jià)值。本研究中以實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法為標(biāo)準(zhǔn)，ELISA法靈敏度76.74%,膠體金法靈敏度74.41%。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法檢出陽性率高于ELISA法和膠體金法，該法靈敏、準(zhǔn)確、可對(duì)病毒分型，適用于HFRS早期病例實(shí)驗(yàn)室診斷。10份IgM抗體陰性病毒核酸陽性標(biāo)本中，6份（60%）樣本病后血清采集時(shí)間≦3 d，提示發(fā)病后血清采集時(shí)間小于等于3 d的樣本進(jìn)行IgM抗體檢測(cè)容易出現(xiàn)漏診。

隨著病毒核酸檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)因靈敏、特異、易于標(biāo)準(zhǔn)化的特點(diǎn)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于病毒分子診斷中。新冠疫情之后，基層核酸檢測(cè)能力大大提升，縣級(jí)以上的醫(yī)療結(jié)構(gòu)都已具備實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)能力。

因此我們建議醫(yī)療機(jī)構(gòu)運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光RTPCR法對(duì)疑似HFRS早期病例，尤其是發(fā)病3 d內(nèi)的病人進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，提高實(shí)驗(yàn)室診斷的陽性率，減少漏診，切實(shí)做到早診斷、早治療。