雷健，伍柏青，杜宇娜，李蓉

（江西省人民醫(yī)院、南昌醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006）

血液學(xué)參數(shù)在血液常規(guī)檢查中一直被認(rèn)為是全身炎癥反應(yīng)的標(biāo)志[1-2]。血小板檢驗(yàn)，作為血常規(guī)檢驗(yàn)的一部分，對(duì)患者移植后的評(píng)估具有重要臨床意義[3]。BECKMAN COULTER DXH800全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（簡(jiǎn)稱UniCel DxH 800）是一款在臨床實(shí)驗(yàn)室中使用較多的血液分析儀，它通過(guò)應(yīng)用全新的專利技術(shù)和設(shè)計(jì)，提高了儀器的準(zhǔn)確度、精確度、敏感性和特異性，但我們?cè)谂R床檢驗(yàn)工作中發(fā)現(xiàn)其在血小板參數(shù)的檢驗(yàn)方面仍有不足。器官移植術(shù)后的急性排斥反應(yīng)(Acute rejection,AR)增加了移植物功能不全的風(fēng)險(xiǎn)，是影響移植物長(zhǎng)期存活的主要因素。研究表明，大血小板的檢測(cè)對(duì)實(shí)行移植手術(shù)后的急性排斥反應(yīng)診斷有一定的輔助作用[3]。

我們回顧性觀察分析使用DXH800全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)移植手術(shù)后患者血常規(guī)標(biāo)本中的大血小板的準(zhǔn)確性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病例資料 對(duì)2021年8月24日至2021年9月11日在江西省人民醫(yī)院使用DXH 800全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血常規(guī)檢查的器官移植患者共602例進(jìn)行篩選，包括在器官移植科、器官移植科ICU住院的患者和在器官移植科門診就診的患者。篩選標(biāo)準(zhǔn)為：在近兩年在我院器官移植科進(jìn)行了肝或腎同種異體移植術(shù)，供受者血型相符，淋巴細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)陰性，群體反應(yīng)性抗體陰性，HLA配型檢測(cè)A、B、DR共3個(gè)位點(diǎn)，錯(cuò)配1～4個(gè)位點(diǎn)；截止至2021年9月11日，患者最后一次血常規(guī)結(jié)果中血小板計(jì)數(shù)＜100×10^9/L。

腎移植術(shù)后AR診斷標(biāo)準(zhǔn)：臨床表現(xiàn)為尿量明顯減少、血壓升高、發(fā)熱、移植腎區(qū)脹痛；實(shí)驗(yàn)室檢查血肌酐明顯升高；移植腎彩色多普勒超聲檢查移植腎各級(jí)動(dòng)脈血管阻力指數(shù)升高（RI＞0.75）[4-5];移植腎穿刺活檢病理符合Banff標(biāo)準(zhǔn)[6]。肝移植術(shù)后AR診斷標(biāo)準(zhǔn)：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽紅素（TBIL）和直接膽紅素（DBIL）逐漸增高；彩色多普勒超聲檢測(cè)移植肝肝動(dòng)脈血流信號(hào)明顯減少且阻力指數(shù)升高，肝靜脈頻譜形態(tài)變化，波幅下降，頻譜變鈍[7-8]。

本研究共篩選觀察分析對(duì)象37例，其中男性30例，女性7例，年齡28～64歲，平均年齡47.2歲。

1.2 儀器與材料 BECKMAN COULTER DXH800血細(xì)胞分析儀及配套的試劑和質(zhì)控品；奧林巴斯光學(xué)顯微鏡；貝索瑞氏-吉姆薩復(fù)合染色液。

1.3方法 用EDTA抗凝管采集患者的靜脈血2 ml，顛倒混勻5～10次后備用。標(biāo)本檢測(cè)嚴(yán)格按照血液分析儀操作規(guī)程進(jìn)行操作并得到血小板計(jì)數(shù)結(jié)果和血小板直方圖。將患者的靜脈血推片使用瑞氏-吉姆薩復(fù)合染色液染色，通過(guò)顯微鏡觀察血小板數(shù)量、形態(tài)，確定有無(wú)大血小板和巨血小板及其數(shù)量多少。

血小板數(shù)量的評(píng)估方法參照國(guó)際血液學(xué)復(fù)檢專家組推薦的方法[9]：在油鏡下，在血涂片分布良好的區(qū)域，一個(gè)血小板大約相當(dāng)10*10^9/L的血小板計(jì)數(shù)量。每個(gè)血涂片在油鏡下觀察20個(gè)左右的視野，將每個(gè)視野下觀察到的血小板數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并取平均值，作為該血液樣本的血小板數(shù)量相對(duì)真實(shí)值。

2 結(jié)果

2.1 我們對(duì)上述篩選出的37份患者血小板計(jì)數(shù)<100×10^9/L的血常規(guī)結(jié)果進(jìn)行觀察分析，其中有13份標(biāo)本的血小板直方圖曲線出現(xiàn)異常，主要表現(xiàn)為直方圖曲線不呈現(xiàn)為對(duì)數(shù)正態(tài)擬合曲線，占比35.1%。對(duì)此13份標(biāo)本進(jìn)行鏡檢觀察和統(tǒng)計(jì)，見(jiàn)表1。 此13份標(biāo)本中都觀察到大血小板現(xiàn)象，平均每油鏡視野0～3個(gè)大血小板。

表1 13例血小板直方圖曲線異常標(biāo)本的血小板儀器計(jì)數(shù)與鏡檢計(jì)數(shù)

2.2 對(duì)上述13位病例的病歷、用藥情況和檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明，13位患者之間均有高度的相似性，因此，我們從13位病例患者中選取1例進(jìn)行病例分析。

該病例于2021年8月27日因腹部不適5年余，發(fā)現(xiàn)肝占位性病變1月余，我院以“肝炎后肝硬化失代償期”收入器官移植科診治。入院后，對(duì)患者進(jìn)行各項(xiàng)體格檢查，完善相關(guān)影像學(xué)檢查和血液學(xué)檢驗(yàn)，血小板計(jì)數(shù)166×10^9/L，血小板直方圖無(wú)異常。于2021年08月27日進(jìn)行肝移植。術(shù)后因供肝在重癥醫(yī)學(xué)科治療過(guò)，有潛在感染機(jī)率，結(jié)合供體標(biāo)本送檢結(jié)果予以聯(lián)合抗感染治療，同時(shí)予以免疫抑制、改善貧血及低蛋白血癥、改善凝血功能、預(yù)防血管栓塞、護(hù)肝、制酸護(hù)胃、化痰、支持等治療。當(dāng)日術(shù)后血小板計(jì)數(shù)下降至90×10^9/L，術(shù)后第二日（8月28日至9月6日）儀器血小板計(jì)數(shù)<100×10^9/L，9月10日血小板計(jì)數(shù)回升至187×10^9/L，期間儀器血小板計(jì)數(shù)結(jié)果變化，見(jiàn)圖1。

圖1 儀器血小板計(jì)數(shù)結(jié)果變化

通過(guò)觀察，發(fā)現(xiàn)從8月29日至9月6日，血小板直方圖有尾部抬高現(xiàn)象，以9月3日血常規(guī)結(jié)果為例，見(jiàn)圖2。選取9月6日的血常規(guī)標(biāo)本進(jìn)行推片鏡檢，在油鏡視野下可檢見(jiàn)大血小板，見(jiàn)圖3。平均每油鏡視野可檢見(jiàn)0～2個(gè)大血小板。該血常規(guī)標(biāo)本中儀器血小板計(jì)數(shù)為70×10^9/L，通過(guò)推片鏡檢血小板計(jì)數(shù)相對(duì)真實(shí)值約為83×10^9/L，兩次血小板計(jì)數(shù)結(jié)果存在較大差異。結(jié)合患者其他影像學(xué)檢查和肝功能檢查，ALT和AST明顯升高，可以判斷患者移植肝存在肝功能不全，患者存在一定的排斥反應(yīng)。通過(guò)使用甲潑尼龍和他克莫司等抗排斥藥物，9月10日患者肝功能基本恢復(fù)到正常水平，血小板數(shù)量恢復(fù)到正常水平，血小板直方圖趨于正常。

圖2 患者血常規(guī)結(jié)果及直方圖

圖3 患者血推片鏡檢結(jié)果

其他12位病例病史基本相似，在行移植術(shù)后，血小板數(shù)量下降至100×10^9/L以下，血小板直方圖出現(xiàn)異常，尾部異常抬高，推片可發(fā)現(xiàn)大血小板，結(jié)合其他相關(guān)檢查可斷定存在AR反應(yīng)。通過(guò)使用抗排斥藥物后，可見(jiàn)移植物功能恢復(fù)良好，血小板數(shù)量和形態(tài)恢復(fù)至正常水平。

3 討論

傳統(tǒng)的顯微鏡直接鏡檢法由于對(duì)檢驗(yàn)師技術(shù)水平要求高、操作時(shí)間長(zhǎng)、計(jì)數(shù)重復(fù)性差等原因，目前已基本被血液分析儀法取代。不同品牌的血液分析儀其檢測(cè)血小板的原理并不完全相同[10-12]，如日本希森美康XN-2000全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血小板有兩種方式，一種是基于于鞘流阻抗法的電阻抗法（PLT-I模式)，另一種則是基于流式細(xì)胞術(shù)、核酸熒光染色半導(dǎo)體激光法的光學(xué)法(PLTO模式)。而美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特DXH800全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀則有所區(qū)別，其檢測(cè)血小板使用的原理為電阻抗法。在血小板數(shù)量大于100×10^9/L時(shí)系統(tǒng)將直方圖呈現(xiàn)為對(duì)數(shù)正態(tài)擬合曲線圖，并依據(jù)此圖分析得出最終的血小板數(shù)量，見(jiàn)圖4。當(dāng)樣本中的血小板數(shù)量小于20×10^9/L時(shí)，由于樣本中的血小板數(shù)量極少，儀器無(wú)法計(jì)數(shù)到有統(tǒng)計(jì)意義數(shù)量的血小板，因此所形成的直方圖是不規(guī)則的，見(jiàn)圖5。儀器無(wú)法對(duì)血小板直方圖進(jìn)行擬合形成曲線，所得的血小板結(jié)果也就令人質(zhì)疑，需要依靠檢驗(yàn)人員參照病人的疾病信息判斷儀器的結(jié)果是否可信。當(dāng)樣本中的血小板數(shù)量為20～100×10^9/L時(shí)，部分患者由于處于疾病狀態(tài)，體內(nèi)血小板的形態(tài)發(fā)生異常，其中一種異常類型為出現(xiàn)一定數(shù)量的大血小板，直徑為4～7μm，或者巨血小板，直徑常為7～20μm。在檢測(cè)此類樣本的血小板數(shù)量時(shí)，有一定數(shù)量的血小板可以通過(guò)儀器進(jìn)行識(shí)別計(jì)數(shù)，形成血小板直方圖，并進(jìn)行數(shù)字化分析擬合形成一條曲線，但是該曲線并不符合對(duì)數(shù)正態(tài)分布的規(guī)則，見(jiàn)圖6。從該圖和本實(shí)驗(yàn)案例可知，當(dāng)血小板的體積大于25 fl時(shí)，儀器會(huì)有報(bào)警信息，所形成的血小板直方圖會(huì)產(chǎn)生尾部上翹的現(xiàn)象。

圖4 血小板直方圖圖示

圖5 血小板數(shù)量極少時(shí)的血小板直方圖圖示

圖6 存在大血小板或巨血小板時(shí)的血小板直方圖圖示

通過(guò)人工推片鏡檢計(jì)數(shù)進(jìn)行對(duì)比后可發(fā)現(xiàn)，在排除細(xì)胞碎片、小紅細(xì)胞等干擾的情況下，儀器的血小板計(jì)數(shù)結(jié)果沒(méi)有將大血小板或巨血小板計(jì)數(shù)在內(nèi)，導(dǎo)致兩者之間存在一定的差異，鏡檢血小板計(jì)數(shù)結(jié)果更高。因此，在DXH800血液分析儀檢測(cè)分析出血小板計(jì)數(shù)結(jié)果低于100×10^9/L且直方圖出現(xiàn)異常尾部上翹的現(xiàn)象時(shí)，進(jìn)行人工復(fù)檢修改血小板計(jì)數(shù)結(jié)果并備注有無(wú)大血小板或巨血小板存在是非常有必要的，有利于協(xié)助臨床醫(yī)生對(duì)患者病情進(jìn)行更準(zhǔn)確的診斷。

急性排斥反應(yīng)作為排斥反應(yīng)的一種，是最常見(jiàn)的排斥反應(yīng)類型，多發(fā)生在移植術(shù)后早期，如不及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處理，可導(dǎo)致移植物嚴(yán)重?fù)p害甚至失功。腎移植排斥反應(yīng)分為兩種，一種為移植腎組織間質(zhì)內(nèi)單個(gè)核炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管上皮炎和血管內(nèi)皮炎，另一種為移植腎實(shí)質(zhì)內(nèi)腎小球炎，動(dòng)脈內(nèi)膜炎甚至動(dòng)脈管壁纖維素樣壞死。因此，及時(shí)診斷AR是現(xiàn)階段保證移植物長(zhǎng)期存活的重要環(huán)節(jié)。對(duì)同種異體移植手術(shù)后早期發(fā)現(xiàn)和治療AR的挑戰(zhàn)在于檢測(cè)和篩查移植物的排斥狀態(tài)。腎移植術(shù)后AR的發(fā)生是一種炎癥反應(yīng)過(guò)程。Banff病理分類方法強(qiáng)調(diào)，移植腎動(dòng)脈內(nèi)膜炎是AR的基本病變[13]，而血小板的活化在移植腎動(dòng)脈內(nèi)膜炎的炎癥反應(yīng)過(guò)程中扮演重要角色[14]。肝移植術(shù)后對(duì)AR的監(jiān)測(cè)，除了臨床觀察、生化及影像學(xué)檢查外，主要依據(jù)移植肝活檢組織病理，并采用Banff標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，評(píng)價(jià)方案主要觀察項(xiàng)目為：匯管區(qū)炎癥、膽管損傷、門靜脈或肝靜脈內(nèi)膜炎[15]。文獻(xiàn)表明，術(shù)前血小板計(jì)數(shù)小于49.5×10^9/L可能是肝移植受者不良預(yù)后的預(yù)測(cè)因素；血小板不僅參與止血和組織修復(fù)，還參與肝臟再生[16]。因此，血小板計(jì)數(shù)結(jié)果與臨床肝、腎移植術(shù)后患者病情轉(zhuǎn)歸及預(yù)后息息相關(guān)。

在AR的初始階段，活化的血小板產(chǎn)生各種細(xì)胞因子促進(jìn)血小板與內(nèi)皮細(xì)胞黏附[17]。血小板分泌血栓素A2和二磷酸腺苷共同參與微血栓形成，后者是AR過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[18]。除此之外，血小板活化后產(chǎn)生的鞘氨醇磷酸酯還可促進(jìn)白細(xì)胞的活化和募集[19]。血小板活化釋放活化標(biāo)志物，AR發(fā)生時(shí)血小板活化標(biāo)志物水平升高，升高的血小板活化標(biāo)志物可被三磷酸核苷雙磷酸水解酶(NTPDasel)抑制[20-22]。當(dāng)血小板活化受到抑制后，其活化標(biāo)志物CD61、CD63、PAC-1、PDGF-BB和TGF-β等表達(dá)明顯減少，移植物功能趨于穩(wěn)定[23]。

當(dāng)機(jī)體因炎癥反應(yīng)出現(xiàn)血小板活化時(shí)，血小板（PLT)、血小板壓積（PCT)下降，平均血小板體積（MPV）、血小板體積分布寬度（PDW）、大血小板比率（P-LCR）增加，體積大和差異程度高的血小板含有更多的顆粒和更高的活性[17]。付紹杰[18]等的研究也發(fā)現(xiàn)MPV、PDW和P-LCR可作為提示腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)過(guò)程中血小板活化的重要指標(biāo)。近年有相關(guān)研究表明，腎移植功能延遲恢復(fù)作為腎移植患者常見(jiàn)并發(fā)癥之一，血小板五項(xiàng)參數(shù)中的PDW、MPV和P-LCR對(duì)其有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，早期監(jiān)測(cè)PDW、MPV和P-LCR對(duì)降低腎移植功能延遲恢復(fù)的發(fā)生率有重要意義[19-21]。

本文對(duì)病例的分析研究，與以上報(bào)道一致，驗(yàn)證了大血小板具有作為輔助評(píng)估移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的潛在價(jià)值。通過(guò)對(duì)血液分析儀提供的血小板直方圖，初步判斷是否存在大血小板，利用手工推片進(jìn)一步計(jì)算大血小板的數(shù)量，從而幫助臨床更加及時(shí)了解AR的進(jìn)展?fàn)顩r，指導(dǎo)臨床使用抗AR藥物。在其他疾病或特殊生理狀態(tài)下，大血小板的生成也會(huì)增加，其中以妊娠、腫瘤以及心腦腎疾病多見(jiàn)，妊娠和惡性腫瘤所占比例最高[22]。在以上疾病中，大血小板增多都伴隨血小板的減少，因此可以初步推斷，大血小板為新生成的血小板，活性比正常血小板高，與疾病消耗破壞正常血小板有關(guān)。

綜上所述，使用BECKMAN COULTER DXH800全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀對(duì)腎移植或肝移植的患者進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)時(shí)，應(yīng)對(duì)血小板減少且血小板直方圖異常的結(jié)果進(jìn)行一定的重視，通過(guò)推片鏡檢的方式以確定是否存在大血小板，從而保證血常規(guī)檢驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量，為臨床診斷排斥反應(yīng)提供一定的輔助作用。