韓艷艷，是薔，葛林林

（焦作煤業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司中央醫(yī)院內(nèi)科，河南 焦作 454000）

肺癌是嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性腫瘤之一，且近年來發(fā)病率逐漸呈上升趨勢(shì)，其中最常見的病理類型為非小細(xì)胞肺癌（Non-small-cell lung cancer，NSCLC），約占肺癌的85%[1]。化療在肺癌治療中占有重要地位,目前多采用聯(lián)合化療方案,但療效不理想。多藥耐藥是肺癌化療失敗的根本原因,其耐藥的產(chǎn)生往往是多基因、多途徑的共同作用[2]。研究證實(shí),腫瘤蛋白53(Tumor protein 53,p53)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶-π（Glutathion transferase-π，GST-π）、拓?fù)洚悩?gòu)酶-Ⅱ（Topoisomerase-Ⅱ，Topo-Ⅱ）等是惡性腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥的物質(zhì)基礎(chǔ)，是目前研究的熱點(diǎn)檢測(cè)指標(biāo)[3]。p53是重要的抑癌基因之一，影響著人體基因組穩(wěn)定性，在誘導(dǎo)細(xì)胞周期捕獲、凋亡和DNA修復(fù)等多種生理功能中發(fā)揮作用[4]。GST-π是腫瘤及組織細(xì)胞中最常見的同工酶,能夠催化機(jī)體內(nèi)谷胱甘肽與親電性化合物結(jié)合，與腫瘤的轉(zhuǎn)移浸潤耐藥等多種生物學(xué)行為有關(guān)，是具有研究意義的腫瘤性標(biāo)志物[5]。ToPo-Ⅱ是存在與真核細(xì)胞中的一種核酶，其可引起DNA的二維及三維結(jié)構(gòu)改變，在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、染色體分離及DNA重組中起主要作用[6]。本研究分析了NS CLC患者化療前后外周血p53、ToPo-Ⅱ、GST-π表達(dá)，以及其與患者預(yù)后關(guān)系，探討其臨床價(jià)值，以期為臨床診治NSCLC提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2016年1月至2018年1月期間接受化療的109例NSCLC患者，男、女例數(shù)分別為63例和46例，年齡50～70歲，平均（60.35±7.25）歲；病理類型：腺癌55例，鱗癌54例；臨床分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期16例，Ⅲ期47例，Ⅳ期37例。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合《中華醫(yī)學(xué)會(huì)肺癌臨床診療指南》中的NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，且經(jīng)病理活檢確診，病理資料完整；⑵未行抗腫瘤治療；⑶配合完成了本研究的指標(biāo)檢測(cè);⑷經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過，患者及家屬了解并知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴伴其他惡性腫瘤病癥；⑵無法有效配合研究或缺乏完整的病例資料；⑶感染、免疫或血液系統(tǒng)疾??；⑷其他類型肺癌患者。

1.2 化療方法 所有患者均給予護(hù)心、護(hù)胃、護(hù)肝、止吐等預(yù)防性治療。靜脈滴注長春瑞濱（山西普德藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20041467）25mg·m-2，d1和d8；靜脈滴注順鉑（齊魯制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字H37021362）75mg·m-2，d1～d3，以21d為1個(gè)周期，化療4個(gè)周期。

1.3 主要試劑 RNA抽提試劑Trizol（廣州泰勒生物科技有限公司）；兔抗人p53、GST-π及ToPo-Ⅱ抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；通用型二步法檢測(cè)試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-Hypaque）溶液（廣東省廣州市美景生物科技有限公司）；DAB顯色試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；RIPA蛋白裂解液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京中科瑞泰生物科技有限公司）。

1.4 標(biāo)本采集 化療前后，采集所有患者清晨空腹靜脈外周血，加入肝素鈉抗凝，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），取中間灰白色層，PBS洗滌2次后留取PBMCs備用。

1.5 免疫印跡法（Western blot）檢測(cè) 取各組PBMCs，加入適量RIPA全蛋白裂解液提取總蛋白，經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白濃度，行10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，加5%脫脂奶粉37℃封閉1 h后，加入p53、ToPo-Ⅱ、GST-π一抗（稀釋濃度均為1∶1 000）后4℃搖床過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h，洗膜，曝光，顯影。最后用Quantity-one圖像軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析及光密度值掃描，分別計(jì)算出目的蛋白條帶與GAPDH的強(qiáng)度，然后把結(jié)果相除計(jì)算出其比值為相對(duì)表達(dá)量。

1.6 隨訪 自確診之日對(duì)所有患者開始進(jìn)行電話隨訪或門診復(fù)查，1年內(nèi)每3個(gè)月復(fù)查1次，2年內(nèi)半年復(fù)查1次，以后至少每年復(fù)查一次。2021年1月31日為隨訪截止日期，共計(jì)隨訪36個(gè)月。隨訪記錄患者復(fù)發(fā)情況、生存時(shí)間及隨訪時(shí)狀態(tài)（存活、死亡或其他）等。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析所有數(shù)據(jù)，對(duì)于滿足正態(tài)分布且組間方差齊的計(jì)量資料均采用（±s）表示，兩組間差異采用t檢驗(yàn)分析，三組間差異采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)分析表達(dá)水平及其與臨床病理特征之間的關(guān)系，采用Pearson檢驗(yàn)分析p53、ToPo-Ⅱ、GST-π相關(guān)性，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存率的比較，組間比較采用Log-rankχ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC患者外周血p53、ToPo-Ⅱ、GST-π蛋白表達(dá) 經(jīng)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，NSCLC患者化療后外周血中的p53、ToPo-Ⅱ、GST-π蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于化療前（P＜0.05），見圖1。

圖1 NSCLC患者外周血中p53、ToPo-Ⅱ、GST-π表達(dá)

2.2 化療前p53、ToPo-Ⅱ、GST-π蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 化療前，NSCLC患者外周血中p53蛋白表達(dá)水平與腫瘤直徑、臨床分期及分化程度相關(guān)（P＜0.05）；ToPo-Ⅱ蛋白表達(dá)水平與腫瘤直徑、臨床分期、分化程度以及是否合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05）；GST-π蛋白表達(dá)水平與臨床分期、分化程度以及是否合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），見表1。

表1 外周血中p53、ToPo-Ⅱ、GST-π蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（±s）

表1 外周血中p53、ToPo-Ⅱ、GST-π蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（±s）

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2.3 化療后p53、ToPo-Ⅱ、GST-π蛋白表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系 隨訪3年，109例NSCLC患者中有12例失訪，剩下的97例NSCLC患者。采用中位數(shù)法，將患者分為p53、ToPo-Ⅱ、GST-π高表達(dá)組49例，低表達(dá)組48例。p53低表達(dá)患者3年總生存率為29.63%，中位生存期為29.76個(gè)月，顯著高于ToPo-Ⅱ高表達(dá)患者（18.57%，23.81個(gè)月），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rankχ2=4.467，P=0.034）。ToPo-Ⅱ低表達(dá)患者3年總生存率為31.67%，中位生存期為29.35個(gè)月，顯著高于ToPo-Ⅱ高表達(dá)患者（18.36%，22.28個(gè)月），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rankχ2=4.265，P=0.038）。GSTπ低表達(dá)患者3年總生存率為30.16%，中位生存期為30.26個(gè)月，顯著高于GST-π高表達(dá)患者（20.41%，24.25個(gè)月），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Logrankχ2=4.661，P=0.031），見圖2。

圖2 p53、ToPo-Ⅱ、GST-π蛋白表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后分析

2.4 p53與ToPo-Ⅱ、GST-π相關(guān)性 NSCLC患者外周血中p53與ToPo-Ⅱ蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.221，P=0.027）；p53與GST-π蛋白表達(dá)水平也呈正相關(guān)（r=0.215，P=0.031）。

3 討論

NSCLC是嚴(yán)重危害人類生命健康的惡性腫瘤之一，且其發(fā)生、發(fā)展過程極為復(fù)雜[8]。已有研究顯示，NSCLC發(fā)病過程與患者的體液、細(xì)胞或組織中存在的多種激素、蛋白質(zhì)、癌基因產(chǎn)物及轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)，這些因素對(duì)腫瘤的診斷、臨床預(yù)后評(píng)估等具有重要價(jià)值[9]。目前，治療NSCLC的主要手段是化療,但腫瘤細(xì)胞易對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性導(dǎo)致化療效果不理想[10]。有文獻(xiàn)報(bào)道，在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的諸多基因及蛋白中，p53、TopoⅡ和GSTπ的表達(dá)發(fā)揮了主要的重要[11]。本研究中，NSCLC患者化療前外周血中p53、TopoⅡ、GST-π表達(dá)水平明顯高于化療后。p53抗體編碼的p53蛋白是一種抑癌基因，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，延緩甚至預(yù)防腫瘤細(xì)胞的癌變。p53蛋白在許多腫瘤疾病中都會(huì)發(fā)生突變。一旦發(fā)生突變，它的抑癌功能就會(huì)喪失，從而加速癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)癌變[12]。TopoⅡ是機(jī)體一種重要的核內(nèi)酶，主要位于正常細(xì)胞的S、G、M期，參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組、分離等過程，并可在G2/M期達(dá)至峰值[13]。TopoⅡ不僅可以作為細(xì)胞的增殖指數(shù)，還可以作為抗癌藥物的靶點(diǎn)，其作用機(jī)制為TopoⅡ通過與化療藥物結(jié)合而造成DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄異常，TopoⅡ表達(dá)水平越高，化療藥物具備的靶點(diǎn)越多，對(duì)抗癌藥物敏感性越高[14]。GST-π屬于多基因家族酶類，目前發(fā)現(xiàn)有5種同工酶分別為α、μ、π、θ和膜結(jié)合型，并與機(jī)體解毒作用有關(guān),在許多耐藥細(xì)胞系中呈高水平表達(dá)[15-16]。分析原因，可能由于p53、TopoⅡ、GST-π在腫瘤細(xì)胞中活性更高，且對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制作用減弱，進(jìn)一步促進(jìn)癌細(xì)胞的增長，并共同參與了NSCLC的多藥耐藥，提示可通過抑制p53、TopoⅡ、GST-π活性阻止腫瘤細(xì)胞的生長。

本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者化療前外周血中p53蛋白、ToPo-Ⅱ蛋白和GST-π蛋白表達(dá)水平與臨床分期、分化程度以及是否合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)。這可能是由于p53、TopoⅡ、GST-π可能通過促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和遷移，影響患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期等臨床病理特征。本研究結(jié)果還顯示，NSCLC患者外周血中p53與ToPo-Ⅱ、GST-π蛋白表達(dá)水平均呈正相關(guān)。既往研究顯示，胃癌中TopoⅡ、GST-π與p53蛋白表達(dá)具有正相關(guān)性[17]。分析原因，可能由于p53基因可能參與誘導(dǎo)ToPo-Ⅱ、GST-π蛋白的高表達(dá)，三者共同介導(dǎo)NSCLC的多藥耐藥機(jī)制。提示p53、ToPo-Ⅱ和GST-π可能共同參與了腫瘤耐藥過程，并在腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制中可能存在相互影響，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究通過Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，p53、ToPo-Ⅱ及GST-π高表達(dá)組患者平均生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)組。這說明p53、ToPo-Ⅱ及GST-π在NSCLC的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮一定作用，p53、ToPo-Ⅱ及GST-π高表達(dá)均可提示NSCLC預(yù)后不良。

綜上所述，NSCLC外周血中p53、TopoⅡ、GST-π表達(dá)水平明顯上調(diào)，與患者臨床病理有一定關(guān)系，且高表達(dá)患者生存率較低。