陳梅，陳芳，宋春蘭

（鄭州大學附屬兒童醫(yī)院 河南省兒童醫(yī)院 鄭州兒童醫(yī)院 鄭州市兒童急危重癥醫(yī)學重點實驗室，河南 鄭州 450000）

手足口病（HFMD）是因腸道病毒感染引起的兒科常見急性傳染病，其致病原以腸道病毒71型（EV71）和腸道病毒CA16型較為多見，5歲以下兒童易感[1]。既往研究表明EV71型HFMD在近年來丙類傳染病中致死率占第一位[2]。一般普通型HFMD預后良好，而重癥患兒病死率高、預后差，目前臨床尚未明確該病的致病機制以及致死原因，因此早期預測EV71型HFMD重癥化風險，并及時給予干預十分必要。血清25-羥維生素D[25-（OH）D]是反映機體維生素D（VD）營養(yǎng)狀況的最佳指標，既往常用于評估兒童骨骼生長發(fā)育情況[3]，但近年來多項研究發(fā)現(xiàn)心血管系統(tǒng)、代謝綜合征等多種疾病的發(fā)生均與VD缺乏密切相關(guān)[4-5]。隨著臨床對于VD的進一步研究，發(fā)現(xiàn)血清25-（OH）D水平與兒童多種感染性疾病存在一定的相關(guān)性，并認為通過影響機體免疫功能和炎癥反應程度促使其對病毒易感性增加[6]。淋巴細胞是反應機體免疫功能的重要免疫細胞群，包括T淋巴細胞、自然殺傷細胞（NK）；而基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、白細胞介素-1β（IL-1β）和IL-18均是反映細胞炎癥反應的重要指標。Zhou JF[7]等人研究發(fā)現(xiàn)EV71型感染HFMD患兒體內(nèi)T淋巴細胞亞群以及NK細胞比例隨病情加重呈逐步減少趨勢。但目前仍缺乏關(guān)于EV71型HFMD患兒VD缺乏與免疫功能關(guān)系的系統(tǒng)分析，基于此，本研究通過探討血清25-（OH）D水平與其細胞免疫功能的相關(guān)性，以進一步證實兩者間的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院2019年2月至2021年2月診治的78例EV71型HFMD患兒作為研究組。納入標準：⑴符合HFMD診斷標準[8]；⑵外周血EV71-IgM和咽拭子或肛拭子EV71核酸檢測均為陽性；⑶病程低于5 d；⑷患兒臨床資料完整。排除標準：⑴合并血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等嚴重基礎(chǔ)疾病者；⑵合并其他出疹性疾?。虎墙?個月內(nèi)注射過大劑量VD制劑；⑷近期存在免疫抑制劑或免疫增強劑使用史。另選擇同期健康兒童85例作為對照組。研究組男41例，女37例；年齡1～8歲，平均（3.27±1.16）歲；疾病嚴重程度：普通型53例，重癥型25例。對照組男例，女例；年齡1～9歲，平均（3.52±1.39）歲。兩組研究對象一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法 研究組患兒于入院次日清晨采集空腹靜脈血2 ml+2 ml[2 ml用于檢測血清25-（OH）D水平，另2 ml用于檢測免疫功能]，對照組兒童于體檢當日采集。采用化學發(fā)光法檢測血清25-（OH）D水平，儀器為自動化免疫分析儀，試劑盒由山東英盛生物技術(shù)有限公司提供。具體操作步驟如下：將樣本室溫下靜置30 min，以3000 r/min的速度離心10 min，取上清液，采用自動化免疫分析儀自動檢測，并記錄結(jié)果。采用流式細胞儀檢測外周血T淋巴細胞亞群水平，具體方法：將50μl混勻全血標本與帶有熒光標記的單克隆抗體10μl置于試管，室溫避光孵育20 min，加入溶血素250 μl，混勻，1800 r/min離心5 min，棄去上清液，加磷酸鹽緩沖液250μl，混勻，采用流式細胞儀檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、白細胞介素-1β（IL-1β）和IL-18水平，試劑盒由廈門慧嘉生物科技有限公司提供。

1.3 統(tǒng)計學方法 SPSS20.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，均經(jīng)過正態(tài)分析及方差齊性檢驗，計量資料以表示，行t檢驗；采用Pearson相關(guān)性分析血清25-（OH）D與免疫功能指標相關(guān)性；采用受試者工作特征曲線（ROC）分析血清25-（OH）D與免疫功能指標對于EV71型HFMD患兒重癥化風險預測價值；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清25-（OH）D水平以及免疫功能比較研究組患兒血清25-（OH）D、CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+水平均顯著低于對照組，NK、MMP-9、IL-1β和IL-18水平顯著高于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組血清25-（OH）D水平以及免疫功能比較（±s）

表1 兩組血清25-（OH）D水平以及免疫功能比較（±s）

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2.2 不同疾病嚴重程度血清25-（OH）D水平以及免疫功能比較 重癥型患兒血清25-（OH）D、CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+水平均顯著低于輕癥型，NK、MMP-9、IL-1β和IL-18水平顯著高于輕癥型（P＜0.05）。見表2。

表2 不同疾病嚴重程度血清25-（OH）D水平以及免疫功能比較（±s）

表2 不同疾病嚴重程度血清25-（OH）D水平以及免疫功能比較（±s）

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2.3 血清25-（OH）D與免疫功能指標相關(guān)性 血清25-（OH）D與CD4+、CD8+呈正相關(guān)，與NK呈負相關(guān)（P＜0.05），與CD4+/CD8+之間無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。見表3、圖1-6。

圖1 血清25-（OH）D與CD4+相關(guān)性

表3 血清25-（OH）D與免疫功能指標相關(guān)性

2.4 血清25-（OH）D與細胞免疫功能指標對于EV71型HFMD患兒重癥化風險預測價值 血清25-（OH）D與CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、NK、MMP-9、IL-1β、IL-18均對EV71型HFMD患兒重癥化風險具有較好的預測價值，其截斷值分別為≤37.74 ng/ml、≤26.49%、≤18.41%、≤1.14、＞26.26%、＞95.78 ug/L、＞43.72 ng/L、＞66.25 ng/L，其中以IL-1β、IL-18的AUC值最高（P＜0.05）。見表4、圖7。

表4 血清25-（OH）D與免疫功能指標對于EV71型HFMD患兒重癥化風險預測價值

圖7 EV71型HFMD患兒重癥化風險預測曲線

3 討論

HFMD好發(fā)于夏秋季節(jié)，近年來，我國HFMD發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)明顯上升趨勢，已成為威脅兒童健康的嚴重衛(wèi)生問題，也為家庭以及社會帶來了巨大的經(jīng)濟負擔。目前已有研究表明，異常的免疫炎性反應促使EV71型感染HFMD病情進展[9]，但EV71感染后的宿主獲得性免疫反應，尤其是T淋巴細胞的變化，目前尚不明了。25-（OH）D水平缺乏或不足已被發(fā)現(xiàn)在抗感染、正常免疫功能的維持等方面具有重要意義，國內(nèi)部分學者發(fā)現(xiàn)血清25-（OH）D缺乏與感染性疾病患兒免疫功能降低密切相關(guān)[10]，但對于EV71型感染的HFMD患兒尚缺乏研究。

圖2 血清25-（OH）D與C84+相關(guān)性

圖3 血清25-（OH）D與NK相關(guān)性

圖4 血清25-（OH）D于MMP-9相關(guān)性

圖5 血清25-（OH）D與IL-1β相關(guān)性

圖6 血清25-（OH）D與IL-18相關(guān)性

VD不僅可促進兒童生長發(fā)育，還是一種免疫調(diào)節(jié)劑，具有調(diào)節(jié)免疫細胞的生長以及分化的作用。目前多位研究者發(fā)現(xiàn)25-（OH）D的缺乏是一些感染相關(guān)性疾病的危險因素，甚至與膿毒癥等危重癥患兒死亡密切相關(guān)，增加了疾病的嚴重程度[11]。EV71型HMFD發(fā)病人群以5歲一下嬰幼兒為主，與VD缺乏好發(fā)年齡段相似。Ke Y[12]等人研究發(fā)現(xiàn)EV71型HFMD發(fā)病與感染后固有免疫以及適應性免疫功能紊亂相關(guān)，而VD的抗感染作用也是通過固有免疫以及適應性免疫的調(diào)節(jié)作用發(fā)揮。本研究結(jié)果顯示研究組、重癥型患兒血清25-（OH）D水平顯著低于對照組、普通型，提示EV71型HFMD的發(fā)生、發(fā)展與VD缺乏密切相關(guān)。分析其原因可能為，VD受體可在活化的T細胞上表達，當VD缺乏或不足時，表達VD受體的T細胞減少，進而導致機體免疫功能降低，抗病毒能力降低，促使疾病發(fā)生發(fā)展[13]；EV71型HFMD的發(fā)生會導致神經(jīng)系統(tǒng)和心肺功能受損，VD缺乏或不足會導致能表達VD受體的組織受到抑制，而VD受體基因缺乏后會導致機體對感染性疾病以及自身免疫性疾病的易感性增加。Fisher SA[14]等人研究表明兒童檢測血清25-（OH）D水平缺乏或不足時，其患HFMD的概率大幅度增加，也證明了本研究觀點。

機體炎癥反應的過度激活以及抗病毒免疫防御功能在病毒感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。EV71型HFMD患兒固有免疫呈紊亂狀態(tài)，因EV71入侵后在NK細胞、樹突狀細胞上大量復制，同時其入侵可激活固有免疫細胞，誘導適應性免疫抵抗病原。有學者對HFMD患兒的淋巴細胞亞群分析，發(fā)現(xiàn)其細胞免疫、體液免疫功能均下降[15]。國外也有研究發(fā)現(xiàn)EV71型HFMD感染后，細胞免疫因子出現(xiàn)低水平甚至抑制狀態(tài)，并認為細胞免疫在該病的重癥化中起著重要作用[16]。本研究中，研究組、重癥型患兒CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+水平均顯著低于對照組、普通型，NK、MMP-9、IL-1β、IL-18水平顯著高于對照組、普通型，也提示EV71型HFMD患兒存在免疫功能抑制以及炎癥反應過度激活狀態(tài)，且與該病重癥化關(guān)系密切，進一步證實了既往研究結(jié)果。在此基礎(chǔ)上，本研究進一步對VD與免疫功能、炎癥反應的關(guān)系進行分析，結(jié)果顯示血清25-（OH）D與CD4+、CD8+呈正相關(guān)，與NK、MMP-9、IL-1β、IL-18呈負相關(guān)，與CD4+/CD8+之間無顯著相關(guān)性，提示血清25-（OH）D水平降低可影響EV71型HFMD患兒細胞免疫功能和炎癥反應。究其原因，EV71入侵宿主后會降低免疫細胞活性，導致T淋巴細胞亞群降低，同時VD可調(diào)控機體的免疫應答，大量的VD消耗，導致血清25-（OH）D水平降低；血清25-（OH）D水平降低可反映宿主防御、炎癥反應等功能降低，難以全面抵抗病原菌，從而導致增加嬰幼兒易感性以及病情程度嚴重性[17]；VD可促進白細胞激素的產(chǎn)生，促使活化CD4+、CD8+T淋巴細胞，使其與VD受體結(jié)合，故血清25-（OH）D降低可導致T淋巴細胞活化受到抑制，降低患兒免疫系統(tǒng)的保護作用。此外，EV71侵入機體可激活體內(nèi)的炎癥反應，促使炎癥細胞因子的過度釋放并損傷全身多處器官組織，最終增加HFMD的重癥化風險。既往有學者研究也表明危重癥HFMA患兒存在MMP-9等炎癥因子水平明顯升高現(xiàn)象[18]，與本研究結(jié)果相一致。本研究通過ROC曲線分析，也發(fā)現(xiàn)血清25-（OH）D、T淋巴細胞亞群以及、MMP-9、IL-1β、IL-18均可較好的預測EV71型HFMD患兒重癥化風險，為臨床及時干預治療可提供一定的參考。但本研究仍存在不足之處，因近年來本院HFMD的救治技術(shù)較前明顯提高，危重癥以及死亡患兒較少無法進行分組，故將其合并于重癥組內(nèi)，后續(xù)將繼續(xù)研究；同時血清25-（OH）D以及免疫功能指標的臨界值仍需要通過前瞻性研究驗證其可靠性，以探索其對于EV71型HFMD發(fā)生發(fā)展的預警價值。

綜上所述，EV71型HFMD血清25-（OH）D水平與免疫功能呈正性相關(guān)，與炎癥細胞因子呈負相關(guān)，三者均與疾病重癥化相關(guān)，且可作為該病重癥化的預警因素。監(jiān)測血清25-（OH）D、免疫功能指標以及炎癥細胞因子水平對評估EV71型HFMD患兒嚴重程度、提高干預具有重要意義。