郝 賀，楊春旺，曹 靜，郭曉金，李 幸，汪治宇

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤免疫科，河北 石家莊 050011)

食管癌(esophageal cancer, EC)是臨床常見的惡性腫瘤之一, 進(jìn)行性吞咽困難為典型癥狀。食管癌患者行腫瘤病灶切除仍是可切除食管癌的有效治療方法，然而術(shù)后患者局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高達(dá)40%～60%，是導(dǎo)致食管癌患者病死率的主要原因。腫瘤炎性微環(huán)境可以促進(jìn)腫瘤的增殖、遷移、轉(zhuǎn)移和血管生成[1]。濾泡輔助性T細(xì)胞( T follicular helper cell，Tfh) 屬于CD4+T細(xì)胞亞群，是腫瘤間質(zhì)浸潤性炎性細(xì)胞的重要組成部分[2]。Tfh細(xì)胞表達(dá)CXC趨化因子受體5(CXC chemokine receptor type 5, CXCR5)、趨化因子(CXC基元)配體13(CXC chemokine ligand 13,CXCL-13)、程序性細(xì)胞死亡1(programmed cell death-1，PD-1)等表面分子, 并且分泌白細(xì)胞介素21( interleukin-21，IL-21)，在B細(xì)胞的分化成熟、分泌高親和力抗體及建立長期體液免疫等過程中扮演重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，Tfh細(xì)胞參與了免疫風(fēng)濕性疾病，過敏性疾病及免疫缺陷型疾病的發(fā)生發(fā)展過程[3-6]，近年來，眾多學(xué)者開始探索其在腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用,尤其是在腫瘤炎性微環(huán)境中的功能。目前Tfh細(xì)胞在食管癌領(lǐng)域的研究尚不夠深入，通過對Tfh細(xì)胞及相關(guān)因子的研究，可以增進(jìn)對食管癌炎性微環(huán)境及免疫逃逸機(jī)制的認(rèn)識，并為食管癌早期診斷及復(fù)發(fā)監(jiān)測提供依據(jù)。前期研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗狀細(xì)胞癌患者血清中Tfh細(xì)胞相關(guān)因子PD-1水平較正常人增高[7-8]。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法，收集初診收治的食管鱗狀細(xì)胞癌患者及同時(shí)期的健康人作為研究樣本，通過對比分析食管鱗狀細(xì)胞癌患者及健康人對照組外周血中Tfh細(xì)胞相關(guān)分子可溶性CXCR5(soluble CXCR5，sCXCR5)、可溶性CXCL-13(soluble CXCL-13,sCXCL-13)及IL-21的表達(dá)水平，并結(jié)合臨床病理特征及手術(shù)干預(yù)分析其對sCXCR5、sCXCL13及IL-21的影響，探討Tfh細(xì)胞相關(guān)因子在食管鱗狀細(xì)胞癌疾病發(fā)病機(jī)制上的意義。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取我院2016年6月—2017年4月收治的原發(fā)性食管鱗狀細(xì)胞癌患者65例，男性48例，女性17例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)組織病理檢查確診為食管鱗狀細(xì)胞癌的患者；②未接受化放療及免疫靶向治療者；③無免疫系統(tǒng)疾病及嚴(yán)重感染或器官功能受損的病例者，收集同期我院體檢中心性別和年齡相匹配的30名健康體檢者為對照組，其中男性20例，女性10例，年齡53～72歲。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2主要試劑及儀器 人sCXCR5、sCXCL13及IL-21 ELISA試劑盒。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本的收集及處理 普通促凝真空管收集食管鱗狀細(xì)胞癌患者及正常對照組清晨空腹血5 mL，手術(shù)患者術(shù)后第5天繼續(xù)采血5 mL。室溫靜置30 min,離心后取上清液置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2血清中sCXCR5、sCXCL13及IL-21檢測 ELISA法檢測患者及正常對照組血清sCXCR5、sCXCL13及IL-21的含量，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用t檢檢；不同病理特征組之間表達(dá)差異采用χ2檢驗(yàn)；sCXCR5、sCXCL13及IL-21相關(guān)性分析采用Spearman方法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1食管鱗狀細(xì)胞癌組與正常對照組血清中sCXCR5、sCXCL13及IL-21表達(dá)水平 食管鱗狀細(xì)胞癌組血清sCXCR5、sCXCL13及IL-21水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 食管鱗狀細(xì)胞癌實(shí)驗(yàn)組與健康人對照組血清中sCXCR5,sCXCL13及IL-21表達(dá)水平比較Table 1 Levels of circulating serum sCXCR5, sCXCL13 and IL-21 between ESCC and healthy group

2.2食管鱗狀細(xì)胞癌組手術(shù)前后血清中sCXCR5,sCXCL13及IL-21表達(dá)水平 食管鱗狀細(xì)胞癌組手術(shù)前后血清中sCXCR5、sCXCL13及IL-21表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 食管鱗狀細(xì)胞癌組手術(shù)前后患者血清中sCXCR5、sCXCL13及IL-21表達(dá)水平比較Table 2 Levels of circulating serum sCXCR5,sCXCL13 IL-21 before and after operation in ESCC group

2.3食管鱗狀細(xì)胞癌組血清中sCXCR5、sCXCL13及IL-21表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 血清中sCXCL13和IL-21的表達(dá)水平與臨床病理特征無明顯相關(guān)(P>0.05)，sCXCR5的表達(dá)水平腫瘤體積大小相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 食管鱗狀細(xì)胞癌組患者血清中sCXCR5、sCXCL13及IL-21在不同病理特征組之間表達(dá)的比較Table 3 Comparison of the expression of sCXCR5,sCXCL13 and IL-21 in the serum of patients with esophageal squamous cell carcinoma between groups with different pathological characteristics

2.4食管鱗狀細(xì)胞癌組血清中sCXCR5,sCXCL13及IL-21相關(guān)性分析 食管鱗狀細(xì)胞癌患者外周血清中sCXCR5、sCXCL13及IL-21所得數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，故行Spearman相關(guān)性分析,結(jié)果所示，sCXCR5與sCXCL13無相關(guān)性(r=-0.152,P>0.05)；sCXCR5與IL-21無相關(guān)性(r=0.112,P>0.05)；IL-12與sCXCL13無相關(guān)性(r=0.263,P>0.05)。

3 討 論

最新的研究數(shù)據(jù)表明，食管癌在世界常見惡性腫瘤排名中位于第8位，其病死率居第6位[9]。我國屬于食管癌高發(fā)國家，其發(fā)病率在惡性腫瘤中約為第6位，病死率居第4位。食管鱗狀細(xì)胞癌為最主要組織病理學(xué)類型，其百分比占食管癌發(fā)病率的90%以上[10-11]。目前食管癌的治療方式主要為手術(shù)、內(nèi)鏡切除及放化療，但預(yù)后仍然較差，病死率未得到根本改善。加深對食管癌免疫逃逸機(jī)制的探索，深入開展食管癌免疫微環(huán)境的基礎(chǔ)研究，成為食管癌治療的當(dāng)務(wù)之急。與胃腸道腫瘤研究類似，食管癌分子機(jī)制的主要研究集中在腫瘤細(xì)胞本身，即致癌基因的活化(如cyclin D1和EGFR)和抑癌基因的失活(如TP53，p120catenin，E-鈣黏蛋白)[12-14]。但是，越來越多的證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境也是食管癌發(fā)生的必要因素。這些外環(huán)境中包括免疫細(xì)胞、活性成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、內(nèi)皮細(xì)胞、血管周細(xì)胞、神經(jīng)元等，這些因素構(gòu)成了腫瘤賴以生存的微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境在抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)免疫逃避，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，血管生成，侵襲和轉(zhuǎn)移等方面起到了一定促進(jìn)作用[15-16]。

Tfh細(xì)胞是輔助性CD4+T細(xì)亞群，屬于腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的重要組成部分，能持續(xù)分泌CXCR5，后者與趨化因子CXCL13結(jié)合后使Tfh細(xì)胞遷移至濾泡區(qū)參與生發(fā)中心的形成。在可誘導(dǎo)共刺激分子(inducible T cell co-stimulator，ICOS)與CD40L共同作用下，Tfh細(xì)胞分泌效應(yīng)因子IL-21發(fā)揮重要的免疫作用。Tfh細(xì)胞不僅與自身免疫性疾病、感染性疾病及免疫缺陷型疾病相關(guān)，目前越來越多的學(xué)者也開始探索其在腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用。研究表明，在淋巴系統(tǒng)腫瘤中，浸潤性的Tfh細(xì)胞與較差的預(yù)后相關(guān)，然而在非淋巴系統(tǒng)腫瘤中Tfh細(xì)胞與較好的預(yù)后相關(guān)[17-19]。

已有研究表明，Tfh細(xì)胞趨化因子CXCR5及其配體CXCL13在腫瘤細(xì)胞的增殖及發(fā)展中具有重要影響。Qi等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌晚期患者中，CXCR5及CXCL13的表達(dá)水平與結(jié)直腸腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度、神經(jīng)浸潤等因素密切相關(guān)。Duan等[21]研究指出肝細(xì)胞癌患者血清中游離的CXCL13上升，與肝癌術(shù)后的復(fù)發(fā)率存在一定相關(guān)性。Ohandjo等[22]研究表明，CXCR5及CXCL13的表達(dá)水平與前列腺癌患者病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性。Stolfi等[23]研究表明，IL-21可增強(qiáng)炎性微環(huán)境并促進(jìn)了結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌的發(fā)展，阻斷IL-21可能會(huì)降低結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管鱗狀細(xì)胞癌組血清中sCXCR5、sCXCL13、IL-21水平較正常對照組增高，這與上述學(xué)者的研究觀點(diǎn)大致相同。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)食管癌術(shù)后患者，血清中sCXCR5、sCXCL13及IL-21未發(fā)生明顯改變，這可能與患者術(shù)后第5天機(jī)體仍依然處于應(yīng)激有關(guān)。針對食管鱗狀細(xì)胞患者的臨床病理特征與sCXCR5、sCXCL13及IL-21表達(dá)水平相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)血清中sCXCR5表達(dá)水平與食管鱗狀細(xì)胞患者的腫瘤體積大小相關(guān)，提示sCXCR5表達(dá)水平與腫瘤負(fù)荷情況有一定相關(guān)性。

本研究還有許多不足：只監(jiān)測了患者術(shù)后第5天外周血清中sCXCR5、sCXCL13及IL-21表達(dá)情況，應(yīng)進(jìn)一步延長監(jiān)測時(shí)間，了解患者免疫狀態(tài)，觀察與患者病情變化的關(guān)系；檢測食管鱗狀細(xì)胞癌患者組織中sCXCR5、sCXCL13及IL-21的水平，追蹤觀察患者的生存期，明確是否與外周血清中sCXCR5、sCXCL13及IL-21表達(dá)有相關(guān)性，可否作為預(yù)后指標(biāo)；增加檢測手段進(jìn)行論證，如流式細(xì)胞術(shù)、Western蛋白水平及PCR基因水平的檢測。

近年來，濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T follicular regulatory cell，Tfr)在自身免疫性疾病與腫瘤的研究中成為熱點(diǎn)。Tfr細(xì)胞屬于Treg細(xì)胞亞型，來源于天然Treg細(xì)胞。Tfr細(xì)胞不僅可以表達(dá)Treg細(xì)胞相關(guān)的抑制性調(diào)節(jié)因子，還具有Tfh細(xì)胞的特性，可表達(dá)CXCR5、ICOS等因子。在功能方面，Tfr細(xì)胞通過抑制Tfh和B細(xì)胞來特異性地控制生發(fā)中心的應(yīng)答[24]。研究表明，Tfh與Tfr在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤等癌種的疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[25-28]。相信通過對食管鱗狀細(xì)胞癌中Tfh與Tfr的深入研究，可以加深對食管鱗狀細(xì)胞癌炎性微環(huán)境的理解，為食管鱗狀細(xì)胞癌的治療提供新的方向。