盧玉潤，唐宇帆

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，四川省人民醫(yī)院老年內(nèi)科，四川 成都 610072；2.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院/四川大學(xué)華西第四醫(yī)院檢驗科，四川 成都 610041)

心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷可引起缺血區(qū)域心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、細(xì)胞發(fā)生凋亡，導(dǎo)致心肌收縮能力下降，誘發(fā)心功能障礙，使患者疾病加重，成為限制急性心肌梗死和冠心病等心血疾病臨床治療的重要因素[1]。因此，深入探討I/R損傷進展機制對心血管疾病的防治具有重要意義。近年大量研究報道，I/R損傷可引起某些微小RNAs(microRNAs，miRNAs)表達(dá)的改變，而這些miRNAs可通過調(diào)控心肌細(xì)胞應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡等過程參與I/R損傷[2-4]。miR-29b是一種與心血管疾病密切相關(guān)的miRNA，被證實在心肌I/R損傷中表達(dá)下調(diào)，且發(fā)揮抗心肌細(xì)胞凋亡的重要作用[5]。黃連素又名小檗堿，是從中藥黃連根莖中提取的一種生物堿，具有抗炎、抗氧化和抗癌等多種藥理作用[6]。大量研究顯示，黃連素對心肌I/R損傷具有一定的保護作用，但其具體的保護機制并未闡明[7-9]。有研究顯示，黃連素可通過上調(diào)miR-29b促進缺血誘導(dǎo)的血管生成并改善心臟功能，但其是否通過調(diào)控miR-29b表達(dá)參與保護I/R損傷未見報道[10]。缺氧/復(fù)氧(hypoxia reoxygenation，H/R)模型是體外模擬I/R損傷的常用細(xì)胞模型，本研究采用H9c2心肌細(xì)胞構(gòu)建H/R細(xì)胞模型，觀察miR-29b在黃連素保護H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷中的作用，旨在為黃連素用于抗心肌I/R損傷提供新的參考依據(jù)。

1 材 料 與 方 法

1.1細(xì)胞、藥品與試劑 大鼠胚胎心肌細(xì)胞株H9c2購于中科院上海細(xì)胞庫。黃連素(純度98%)購于中國藥品檢驗所，DMEM/F12中糖培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司，胎牛血清購于杭州四季青公司，0.25%胰蛋白酶購于美國Gibco公司，TRIzol RNA 裂解液和脂質(zhì)體2000購于美國Invitrogen公司，辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗購于北京中杉生物技術(shù)公司，第10染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)抗體和磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購于美國Abcam公司。miR-29b mimics、miR-29b inhibitor及相應(yīng)的陰性對照購于上海吉瑪制藥技術(shù)公司，放射免疫沉淀測定(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)蛋白裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液和二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid disodium，BCA)蛋白檢測試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所，psiCHECK-2熒光素酶載體購于西安賽拓博泰生物科技有限公司。膜聯(lián)蛋白/碘化丙啶凋亡試劑盒購于美國Biouniquer 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)活性檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)公司，乳酸鹽脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，熒光素酶活性檢測試劑盒購于美國Promega公司，Takara點突變試劑盒購于上海聯(lián)邁生物公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、分組和H/R模型構(gòu)建 H9c2細(xì)胞采用含100 U/mL青霉素-鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM/F12中糖培養(yǎng)基在條件為CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃ 、濕度飽和的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和傳代。將第3代對數(shù)期細(xì)胞分為：對照組(正常培養(yǎng))、H/R組(行H/R處理)和Ber組(行H/R處理前給予終濃度為150 μmol/L Ber處理24 h)。H/R處理：采用5%CO2-95%N2混合氣體平衡的無血清無糖的DMEM/F12培養(yǎng)基替換H9c2細(xì)胞原培養(yǎng)液后，放入以4 L/min流速通有95%N2-5%CO2混合氣體的缺氧裝置中缺氧處理4 h，再用含血清的DMEM/F12中糖培養(yǎng)基替換細(xì)胞培養(yǎng)液，并在5%CO2-95%O2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中復(fù)氧處理4 h，即為H/R細(xì)胞模型。

1.2.2MTT檢測細(xì)胞存活率 以每孔6×103個/孔密度將H9c2細(xì)胞接種至96孔板上，常規(guī)培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞按照1.2.1中的分組，每組設(shè)置5個復(fù)孔，并以不含細(xì)胞的組作為空白組。處理結(jié)束后，每孔加入四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)溶液20 μL，再孵育4 h后，棄培養(yǎng)液，加入150 μL的二甲基亞砜孵育10 min，上酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞的光密度(optical density，OD)值，并根據(jù)公式：細(xì)胞存活率(%)=(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)。實驗重復(fù)3次。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 收集對照組、H/R組和Ber組細(xì)胞，磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞2次，加入Binding Buffer 制備濃度單細(xì)胞懸液(為2×104個/mL的)。取5 μL Annexin V-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)和 5 μL PI依次加入100 L細(xì)胞懸液中，避光染色10 min。1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。實驗重復(fù)3次。

1.2.4試劑盒檢測細(xì)胞上清液中LDH釋放量 收集按照1.2.1中的分組處理結(jié)束后的對照組、H/R組和Ber組細(xì)胞上清液，參照LDH試劑盒說明書步驟檢測各組細(xì)胞上清液中LDH的釋放量。實驗重復(fù)3次。

1.2.5Caspase-3活性檢測 收集按照1.2.1中的分組處理結(jié)束后的各組細(xì)胞，參照Caspase-3活性檢測試劑盒說明書步驟測定各組細(xì)胞Caspase-3活性。實驗重復(fù)3次。

1.2.6RT-PCR檢測細(xì)胞中miR-29b的表達(dá) TRIzol裂解液提取對照組、H/R組和Ber組細(xì)胞總RNA，測啶RNA的濃度與純度后進行反轉(zhuǎn)錄合成成cDNA。以單鏈cDNA為模板，按照95 ℃ 6 min，95 ℃ 60 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s(40個循環(huán))，72 ℃ 10 min的反應(yīng)程序上PCR儀進行擴增，采用2-△△CT法分析miR-29b表達(dá)水平。其中，miR-29b上游引物序列為5＇-CGTAGCACCATTTGAAAT-CAGTGTT-3＇，下游引物序列為5＇-GTGCAG-GGTCCGAGGT-3＇；內(nèi)參U6上游引物序列為5＇-CTCGCTTCGGCAGCACA-3＇，下游引物序列為5＇-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3＇。

1.2.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)期H9c2細(xì)胞以1×104個/孔接種至6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)75%時，將細(xì)胞分為H/R+Ber+anti-miR-29b組(轉(zhuǎn)染miR-29b inhibitor后行H/R和Ber處理)和H/R+Ber+anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-29b inhibitor 陰性對照后行H/R和Ber處理)，參照脂質(zhì)體2000說明書步驟根據(jù)實驗分組將miR-29b inhibitor及其陰性對照轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，參照1.2.1中的步驟進行H/R和Ber處理。處理結(jié)束后，收集H/R+Ber+anti-miR-29b組、H/R+Ber+anti-miR-NC組以及1.2.1中的對照組、H/R組和H/R+Ber組細(xì)胞，分別采用RT-PCR、MTT法、LDH試劑盒、流式細(xì)胞儀、Caspase-3活性檢測試劑盒分別檢測各組細(xì)胞中miR-29b的表達(dá)水平、細(xì)胞存活率、細(xì)胞上清液中LDH釋放量、細(xì)胞凋亡率和Caspase-3活性。后期miR-29b對PTEN蛋白表達(dá)的影響實驗中，將另接種一板細(xì)胞，將其分為miR-29b組(轉(zhuǎn)染miR-29b mimics)、anti-miR-29b組(轉(zhuǎn)染miR-29b inhibitor)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-29b mimics陰性對照)、anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-29b inhibitor陰性對照)，參照脂質(zhì)體2000說明書步驟根據(jù)上述分組進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞，采用Western blot檢測PTEN蛋白表達(dá)水平。

1.2.8雙熒光素酶報告基因的實驗驗證miR-29b和PTEN的靶向關(guān)系 運用miRanda、miRBase和TargetScan三大生物信息學(xué)工具預(yù)測miR-29b的潛在靶基因，最終確定PTEN為研究對象，將含有能夠與miR-29b結(jié)合的PTEN3′非翻譯區(qū)(untranslated Regions，UTR)序列結(jié)構(gòu)或利用Takara點突變試劑盒定位突變的序列結(jié)構(gòu)進行克隆并轉(zhuǎn)入psiCHECK-2熒光素酶載體中，分別構(gòu)建PTEN野生型(PTEN-WT)和PTEN突變型(PTEN-MUT)載體，并將其分別與miR-29b mimics、miR-29b inhibitor及其相應(yīng)對照共轉(zhuǎn)染48 h后，參照熒光素酶檢測試劑盒說明書步驟測定各組細(xì)胞熒光素酶活性。實驗重復(fù)3次。

1.2.9Western blot檢測PTEN蛋白表達(dá) RIPA蛋白裂解液提取對照組、H/R組和Ber組細(xì)胞總蛋白。按照60 μg/孔將蛋白樣品上樣至SDS-PAGE凝膠中進行電泳，并電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。膜封閉后，轉(zhuǎn)至一抗工作液(PTEN 1∶1 000和GAPDH 1∶1 000)中4 ℃下孵育24 h。再用二抗工作液室溫孵育1 h。化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影、曝光，采用凝膠成像系統(tǒng)分析目的條帶相對灰度值表示目的蛋白表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用單因素方差分析、SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1黃連素對H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷的保護作用與對照組比較 H/R處理后細(xì)胞存活率明顯降低，而細(xì)胞上清液中LDH釋放量和細(xì)胞凋亡率、Caspase-3活性均明顯升高(P<0.05)；但給予黃連素處理后H/R引起的上述變化明顯受到抑制(P<0.05)。見圖1和表1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況

表1 各組細(xì)胞存活率、凋亡率和Caspase-3活性比較Table 1 Comparison of cell survival rate,apoptosis rate and Caspase-3 activity in each group

2.2黃連素上調(diào)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中miR-29b表達(dá) 與對照組比較，H/R處理后H9c2細(xì)胞中miR-29b的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；但是，給予黃連素處理后的H/R引起的miR-92b表達(dá)下降明顯受到抑制(P<0.05)。見表2。

2.3下調(diào)miR-29b逆轉(zhuǎn)黃連素對H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷的保護作用 與對照組比較，H/R處理后H9c2細(xì)胞中miR-29b表達(dá)水平明顯降低，而細(xì)胞上清液中LDH釋放量以及細(xì)胞凋亡率、Caspase-3活性明顯升高(P<0.05)；與H/R組比較，給予黃連素處理后H/R引起的上述變化明顯受到抑制(P<0.05)；但是，轉(zhuǎn)染miR-29b inhibitor成功下調(diào)miR-29b表達(dá)可阻斷黃連素對H9c2細(xì)胞損傷的保護作用(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染miR-29b inhibitor陰性對照對黃連素的保護作用無明顯影響(P>0.05)。見圖2，表3。

表2 各組細(xì)胞中miR-29b和PTEN蛋白表達(dá)比較Table 2 Expression of miR-29b and PTEN protein in cells of each group

圖2 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況A.對照組;B.H/R組;C.H/R+Ber組;D.H/R+Ber+anti-miR-NC組;E.H/R+Ber+anti-miR-29b組Figure 2 Cell apoptosis detected by flow cytometry-in each group

表3 各組中miR-29b表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率和Casapse-3活性比較Table 3 Comparison of miR-29b expression level, apoptosis rate and Caspase-3 activity in each group

2.4PTEN是miR-29b靶基因 生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，PTEN 3′ UTR區(qū)域存在能夠與miR-29b互補的結(jié)合位點，見表3。與PTEN-WT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的miR-29b 組細(xì)胞的熒光素酶活性較miR-NC組明顯降低(P<0.05)；而與PTEN-WT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的anti-miR-29b 組細(xì)胞的熒光素酶活性較anti-miR-NC組明顯升高(P<0.05)；但是，同PTEN-MUT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的miR-29b 組或者anti-miR-29b 組細(xì)胞的熒光素酶活性與相應(yīng)對照比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示，miR-29b組細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)水平較miR-NC組明顯降低(P<0.05)；而anti-miR-29b組細(xì)胞中PTEN 蛋白的表達(dá)水平較anti-miR-NC組明顯升高(P<0.05)。見圖3和表4。

表3 PTEN 3′ UTR與miR-29b的結(jié)合位點Table 3 Binding sites of PTEN 3 ′UTR and miR-29b

圖3 Western blot檢測PTEN蛋白的表達(dá)

表4 各組細(xì)胞熒光素酶活性和PTEN蛋白表達(dá)水平的比較Table 4 Comparison of luciferase activity and PTEN protein expression in cells of each group

3 討 論

心肌細(xì)胞壞死是導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的重要方式，而LDH是目前檢測細(xì)胞壞死的重要手段，LDH是機體代謝過程中一種重要的蛋白酶，細(xì)胞膜受損后，胞內(nèi)的LDH大量外漏，而其外漏程度可間接反映出細(xì)胞的受損程度[11-12]。另外，除心肌細(xì)胞壞死外，心肌細(xì)胞凋亡也是造成心肌細(xì)胞死亡的重要方式，其可造成的組織損傷和心功能障礙，被認(rèn)為是I/R損傷發(fā)生的重要機制[13-14]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的重要執(zhí)行因子，其活性的高低可反映細(xì)胞凋亡程度[15]。本研究對心肌H9c2細(xì)胞H/R處理后顯示，H9c2細(xì)胞活性降低，細(xì)胞上清液中LDH釋放量、細(xì)胞凋亡率以及Caspase-3活性均顯著升高。這表明H/R可誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞損傷。同時，給予黃連素作用后，H/R引起的H9c2細(xì)胞損傷明顯得到改善。這與Zhao等[9]得到的黃連素具有保護H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷的結(jié)果相吻合。

miR-29b是miR-29家族成員，定位于人7q32和1q32染色體上，可通過調(diào)控細(xì)胞凋亡參與腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[16-17]。有研究指出，miR-29b可通過抑制p53依賴的凋亡途徑、增強細(xì)胞活力、降低LDH滲漏，減輕氧和葡萄糖剝奪/再灌注誘導(dǎo)的損傷[18]。已有文獻指出miR-29b具有保護I/R損傷的作用[5]。本研究結(jié)果顯示，H/R處理后H9c2細(xì)胞中miR-29b的表達(dá)水平顯著下調(diào)，而黃連素可上調(diào)miR-29b表達(dá)。這提示miR-29b可能在黃連素保護H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮著重要作用。通過轉(zhuǎn)染miR-29b inhibitor成功下調(diào)miR-29b表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，黃連素對H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷的保護作用明顯減弱。文獻報道，miR-29b表達(dá)上調(diào)是黃連素促進缺血誘導(dǎo)的血管生成并改善心臟功能的重要機制[10]。結(jié)果提示，miR-29b在黃連素保護H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮著積極作用。

PTEN是一種與I/R密切相關(guān)的調(diào)控基因，被證實在I/R大鼠心肌組織中異常高表達(dá)，而下調(diào)其表達(dá)可減少H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷[19-21]。已有研究在小鼠神經(jīng)元GT1-7細(xì)胞、人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中證實PTEN是miR-29b的靶基因[22-23]。本研究通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實在H9c2細(xì)胞中miR-29b與PTEN 3’UTR的靶向結(jié)合，且miR-29b對PTEN表達(dá)具有負(fù)向調(diào)控作用。結(jié)果表明，miR-29b/PTEN途徑可能在黃連素保護H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷中發(fā)揮作用。

綜上所述，miR-29b在黃連素保護H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷中發(fā)揮著重要作用，其作用機制可能與靶向調(diào)控PTEN有關(guān)。該結(jié)果為黃連素臨床抗I/R損傷提供了新的參考依據(jù)。