魏利娟，馬亞飛，陳小莉，郭仲輝，王鵬華

心肌細(xì)胞損傷是引起心血管疾病的重要原因之一，其中，炎癥反應(yīng)引起的心肌細(xì)胞凋亡是誘發(fā)心肌細(xì)胞損傷的重要因素，脂多糖(LPS)屬于革蘭陰性菌胞壁的重要成分，LPS可促進(jìn)炎癥反應(yīng)從而加重心肌細(xì)胞損傷，因此，如何減輕心肌細(xì)胞損傷成為治療心血管疾病的關(guān)鍵[1]。右美托咪定可抑制高遷移率族蛋白B1(HMGB1)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧/復(fù)氧損傷[2-3]。但相關(guān)麻醉藥物對心肌細(xì)胞損傷的作用機(jī)制尚未完全闡明。布托啡諾是人工合成的一種阿片受體激動劑，其可激活心肌阿片受體從而保護(hù)心肌細(xì)胞。研究表明，布托啡諾通過抑制線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而減輕心肌缺血再灌注損傷[4]。微小RNA(miRNA)在LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中可發(fā)揮重要調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖通過調(diào)節(jié)miR-127表達(dá)而減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥損傷[5]。但布托啡諾是否可通過調(diào)控某些miRNA表達(dá)從而發(fā)揮作用尚未闡明。微小RNA-665(miR-665)在心肌缺血再灌注損傷中表達(dá)水平升高，敲低其表達(dá)可激活p21激活激酶-1(PAK1)/蛋白激酶B(Akt)信號通路，從而減輕心肌細(xì)胞損傷[6]。但布托啡諾是否通過調(diào)控miR-665的表達(dá)影響LPS致心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡尚未可知。因此，本研究采用LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，探討布托啡諾是否可通過調(diào)控miR-665的表達(dá)從而參與LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡過程，并探究其可能作用機(jī)制，為進(jìn)一步闡明布托啡諾治療心血管疾病的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 布托啡諾購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；大鼠心肌細(xì)胞H9C2購自上海鈺博生物科技有限公司；LPS購自上海滬鼎生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)檢測試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司；DMEM、胎牛血清購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；膜聯(lián)蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海瑞楚生物科技有限公司；anti-miR-NC、anti-miR-665、miR-NC、miR-665 mimics購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠Bcl-2、Bax抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 心肌細(xì)胞接種于96孔板(5×103個(gè)/孔)上，分別加入濃度為10 mg/L LPS的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h[7]，設(shè)為LPS組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為Con組。使用不同濃度(1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L)的布托啡諾與含有濃度為10 mg/L LPS的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h[8]，分別設(shè)為LPS+Bu-L組、LPS+Bu-M組、LPS+Bu-H組。參照Lipofectamine2000試劑說明書分別將anti-miR-NC、anti-miR-665轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，加入含有濃度為10 mg/L LPS的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，分別設(shè)為LPS+anti-miR-NC組、LPS+anti-miR-665組。參照Lipofectamine2000試劑說明書分別將miR-NC、miR-665 mimics轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，加入含有4 μmol/L布托啡諾與10 mg/L LPS的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，分別設(shè)為LPS+Bu+miR-NC組、LPS+Bu+miR-665組。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測TNF-α、IL-6水平 取各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，采用ELISA法檢測TNF-α、IL-6水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 取各組心肌細(xì)胞加入預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，棄上清，加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后依次加入Annexin Ⅴ-FITC(5 μL)與PI(5 μL)，室溫振蕩孵育10 min，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-665的表達(dá)水平 Trizol法提取各組心肌細(xì)胞中總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)檢測RNA濃度，將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作)，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)(嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40次循環(huán)。應(yīng)用美國ABI ViiA7 qRT-PCR儀檢測miR-665相對表達(dá)量。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 取各組心肌細(xì)胞加入400 μL RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測試劑盒檢測蛋白濃度，蛋白變性后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)反應(yīng)，轉(zhuǎn)膜、封閉，分別孵育一抗稀釋液(1∶1 000)，4 ℃孵育24 h后分別孵育二抗稀釋液(1∶2 000)，室溫孵育1 h后進(jìn)行曝光顯影，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 布托啡諾對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響 與Con組比較，LPS組TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+Bu-L組、LPS+Bu-M組、LPS+Bu-H組TNF-α、IL-6水平依次降低(P<0.05)，且LPS+Bu-L組、LPS+Bu-M組、LPS+Bu-H組TNF-α、IL-6水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 布托啡諾對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎性 因子表達(dá)的影響(±s，n=9) 單位：pg/mL

2.2 布托啡諾對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與Con組比較，LPS組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+Bu-L組、LPS+Bu-M組、LPS+Bu-H組細(xì)胞凋亡率依次降低(P<0.05)，Bax蛋白水平依次降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平依次升高(P<0.05)，且LPS+Bu-L組、LPS+Bu-M組、LPS+Bu-H組細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白、Bcl-2蛋白水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1、表2。

表2 布托啡諾對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響 (±s，n=9)

圖1 布托啡諾對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

2.3 布托啡諾對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-665表達(dá)的影響 與Con組比較，LPS組miR-665表達(dá)水平升高(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+Bu-L組、LPS+Bu-M組、LPS+Bu-H組miR-665表達(dá)水平依次降低(P<0.05)，且LPS+Bu-L組、LPS+Bu-M組、LPS+Bu-H組miR-665表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 布托啡諾對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-665表達(dá)的影響 (±s，n=9)

2.4 抑制miR-665表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎性因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響 與LPS+anti-miR-NC組比較，LPS+anti-miR-665組TNF-α、IL-6水平、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白水平均降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2、表4。

圖2 抑制miR-665表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響(A為凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B為細(xì)胞凋亡流式圖)

表4 抑制miR-665表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎性因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響(±s，n=9)

2.5 miR-665過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了布托啡諾(4 μmol/L)對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎性因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡的作用 與LPS+Bu+miR-NC組比較，LPS+Bu+miR-665組TNF-α、IL-6水平、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白水平均升高，Bcl-2蛋白水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。詳見圖3、表5。

圖3 miR-665過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了布托啡諾對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的作用(A為凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B為細(xì)胞凋亡流式圖)

表5 miR-665過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了布托啡諾對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎性因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡的作用(±s，n=9)

3 討 論

有研究表明，丙泊酚通過靶向miR-181a/ Bcl-2減少蒽環(huán)類藥物誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[9]。丙泊酚通過調(diào)控miR-451/HMGB1分子軸而減輕心肌缺血/再灌注損傷[10]。丙泊酚可減輕心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[11]。表明麻醉藥物具有抗心肌細(xì)胞損傷的作用，但其具體作用機(jī)制尚未闡明。

布托啡諾通過靶向核因子-κB(NF-κB)減輕化膿性大鼠腦損傷[12]。布托啡諾對缺血再灌注損傷心肌具有保護(hù)作用，可降低缺血再灌注損傷心肌炎性因子的釋放，其作用可能與布托啡諾激活κ受體有關(guān)[13]。布托啡諾可減輕膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞損傷[14]。本研究結(jié)果顯示，LPS處理后可明顯提高TNF-α、IL-6水平，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[15]相似，提示心肌細(xì)胞損傷模型建立成功。進(jìn)一步分析顯示，不同劑量的布托啡諾處理后可明顯降低TNF-α、IL-6水平，且隨著藥物劑量的增加而明顯降低，提示布托啡諾可抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，且呈劑量依賴性。心肌細(xì)胞中促炎因子大量釋放可促進(jìn)Bax表達(dá)，Bcl-2屬于抗細(xì)胞凋亡家族成員，而Bax屬于促細(xì)胞凋亡家族成員，其可激活線粒體途徑從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率升高，Bax表達(dá)升高而Bcl-2蛋白表達(dá)降低，不同劑量的布托啡諾處理后可明顯降低LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率，抑制Bax蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)，提示布托啡諾可抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡從而減輕細(xì)胞損傷，且呈劑量依賴性。

本研究結(jié)果顯示，LPS可提高心肌細(xì)胞中miR-665表達(dá)水平，而不同劑量的布托啡諾處理后可明顯降低miR-665表達(dá)水平，且隨著藥物劑量的增加而明顯降低，提示布托啡諾可能通過下調(diào)miR-665表達(dá)從而減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。有研究表明，miR-665上調(diào)表達(dá)通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而促進(jìn)炎癥性腸病細(xì)胞凋亡及結(jié)腸炎[17]。miR-665通過抑制CD34介導(dǎo)的冠狀微血管的血管新生而加重心力衰竭[18]。右美托咪定通過調(diào)控miR-665表達(dá)而對心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮保護(hù)作用[19]。本研究結(jié)果顯示，抑制miR-665表達(dá)可明顯降低LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞TNF-α、IL-6水平及細(xì)胞凋亡率。進(jìn)一步研究顯示，miR-665過表達(dá)可明顯逆轉(zhuǎn)布托啡諾對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎性因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡的作用。提示布托啡諾通過下調(diào)miR-665的表達(dá)從而減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述，布托啡諾可通過下調(diào)miR-665的表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡從而減輕心肌細(xì)胞損傷，其可能作為布托啡諾治療心血管疾病的作用靶點(diǎn)。