劉 頒，姜丕橋，熊桂麗，焦 奇

急性心肌梗死等心血管疾病是威脅人類生命安全的主要疾病，再灌注治療可緩解心肌缺血缺氧，同時(shí)也可加重缺血再灌注損傷，從而降低治療效果，已知氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等是導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷的主要原因，因此，如何減輕心肌細(xì)胞損傷成為治療缺血再灌注損傷的研究熱點(diǎn)[1]。環(huán)狀RNA(circRNA)可充當(dāng)微小RNA(miRNA)的海綿分子，參與心肌細(xì)胞損傷過程，并可能作為治療的潛在靶標(biāo)[2-4]。circPRKCI在脂多糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞中呈低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可通過miR-545/ZEB2分子軸減輕細(xì)胞損傷[5]。但circPRKCI在心肌細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制尚未明確。靶基因預(yù)測(cè)顯示miR-217與circPRKCI存在結(jié)合位點(diǎn)，抑制miR-217表達(dá)通過核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑可防止心肌缺血-再灌注損傷[6]。但circPRKCI是否通過靶向調(diào)控miR-217表達(dá)影響缺氧/復(fù)氧(H/R)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷尚未明確。本研究采用H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，探討circPRKCI/miR-217對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 大鼠心肌細(xì)胞H9c2購自上海弘順生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000、Trizol購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄與熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑購自北京天根生化科技有限公司；pcDNA、pcDNA-circPRKCI購自美國Invitrogen公司；miR-NC、miR-217 mimics、si-NC、si-circPRKCI、anti-miR-NC、anti-miR-217購自廣州銳博生物科技有限公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國Sigma公司；兔抗鼠Bcl-2、Bax抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自美國Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，取對(duì)數(shù)生長期心肌細(xì)胞(1×105個(gè)/mL)接種于96孔板(每孔100 μL)，將培養(yǎng)液更換為不含血清的DMEM培養(yǎng)液，細(xì)胞置入37 ℃，95%N2，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)缺氧處理3 h，之后將培養(yǎng)液更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，將其置入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)復(fù)氧處理4 h[7]，作為H/R組。將正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞作為對(duì)照組。pcDNA、pcDNA-circPRKCI、anti-miR-NC、anti-miR-217、pcDNA-circPRKCI與miR-NC、pcDNA-circPRKCI與miR-217 mimics分別轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞后進(jìn)行H/R處理，分別作為H/R+pcDNA組、H/R+pcDNA-circPRKCI組、H/R+anti-miR-NC組、H/R+anti-miR-217組、H/R+pcDNA-circPRKCI+miR-NC組、H/R+pcDNA-circPRKCI+miR-217組。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞circPRKCI、miR-217表達(dá)水平 采用Trizol法提取各組心肌細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度后置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA合成cDNA，cDNA稀釋20倍后進(jìn)行qRT-PCR，按照試劑盒說明書配置反應(yīng)體系及設(shè)置反應(yīng)條件，應(yīng)用美國ABI StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)circPRKCI、miR-217表達(dá)水平。

1.2.3 檢測(cè)MDA、SOD、GSH-Px含量 采用反復(fù)凍融法裂解各組心肌細(xì)胞，使用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA含量，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD活性，5，5′-二硫代(2-硝基苯甲酸)雙比色法測(cè)定GSH-Px活性，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 各組心肌細(xì)胞中加入預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，棄上清液后收集細(xì)胞沉淀，加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后，分別加入5 μL染色液(Annexin V-FITC)與5 μL碘化丙啶(PI)，充分混勻后室溫孵育10 min，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)circPRKCI與miR-217的靶向關(guān)系 StarBase預(yù)測(cè)顯示circPRKCI與miR-217存在結(jié)合位點(diǎn)，分別構(gòu)建野生型載體WT-circPRKCI與突變型載體MUT-circPRKCI，將其分別與miR-NC、miR-217 mimics共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)24 h并檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.6 免疫印跡法檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 各組心肌細(xì)胞加入400 μL放射免疫沉淀(RIPA)裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉(BCA)法檢測(cè)蛋白濃度后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉2 h后加入一抗稀釋液(1∶1 000)，4 ℃條件下孵育24 h后使用TBST洗滌，加入二抗稀釋液(1∶2 000)后置于室溫孵育1 h，使用TBST洗滌后加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)液，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 circPRKCI和miR-217在H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的表達(dá) 與對(duì)照組比較，H/R組circPRKCI表達(dá)水平降低，miR-217表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。詳見表1。

表1 circPRKCI和miR-217在H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的表達(dá)(±s)

2.2 circPRKCI過表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響 與對(duì)照組比較，H/R組MDA含量、細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)，SOD、GSH-Px、Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)；與H/R+pcDNA組比較，H/R+pcDNA-circPRKCI組MDA含量、細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性增加，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，Bax蛋白水平降低(P<0.05)。詳見圖1、表2。

表2 circPRKCI過表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響(±s)

2.3 circPRKCI靶向調(diào)控miR-217的表達(dá) StarBase預(yù)測(cè)提示circPRKCI與miR-217存在結(jié)合位點(diǎn)，詳見圖2。miR-217過表達(dá)可降低野生型載體WT-circPRKCI熒光素酶活性(P<0.001)，而對(duì)突變型載體MUT-circPRKCI的熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)，詳見表3。與pcDNA組比較，pcDNA-circPRKCI組miR-217表達(dá)水平降低(P<0.05)；與si-NC組比較，si-circPRKCI組miR-217表達(dá)水平升高(P<0.05)，詳見表4。

表3 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s)

表4 circPRKCI調(diào)控miR-217的表達(dá)(±s)

2.4 干擾miR-217表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響 與H/R+anti-miR-NC組比較，H/R+anti-miR-217組MDA含量降低，SOD、GSH-Px活性升高，細(xì)胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白水平升高，Bax蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。詳見圖3、表5。

圖3 干擾miR-217表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響(A為凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖；B為細(xì)胞凋亡流式圖)

表5 干擾miR-217表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響(±s)

2.5 上調(diào)miR-217表達(dá)逆轉(zhuǎn)了circPRKCI過表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用 與H/R+pcDNA-circPRKCI+miR-NC組比較，H/R+pcDNA-circPRKCI+miR-217組MDA含量升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性降低，細(xì)胞凋亡率增加，Bcl-2蛋白水平降低，Bax蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。詳見圖4、表6。

圖4 上調(diào)miR-217表達(dá)逆轉(zhuǎn)了circPRKCI過表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用(A為凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖；B為細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖)

表6 上調(diào)miR-217表達(dá)逆轉(zhuǎn)了circPRKCI過表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用(±s)

3 討 論

急性心肌梗死病理過程復(fù)雜，而心肌缺血再灌注損傷是加重心肌細(xì)胞凋亡的重要原因之一，因而尋找心肌損傷調(diào)控靶點(diǎn)或作用機(jī)制對(duì)提高病人治療效果具有重要的意義。circHIPK3通過miR-29a/胰島素樣生長因子1(IGF-1)通路調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷[8]。沉默circ-0010729通過上調(diào)miR-145-5p減輕心肌細(xì)胞損傷[9]。circRNA-101237通過靶向let-7a-5p/IGF2BP3介導(dǎo)心肌細(xì)胞H/R損傷[10]。但circPRKCI在心肌細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制尚未明確。

circPRKCI在過氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)水平降低，上調(diào)其表達(dá)通過miR-545/589-E2F7軸介導(dǎo)過氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞損傷[11]。本研究結(jié)果顯示，H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞circPRKCI表達(dá)水平降低，提示circPRKCI表達(dá)下調(diào)可能加重心肌細(xì)胞氧化損傷。本研究結(jié)果顯示，H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞MDA含量升高，SOD、GSH-Px活性降低，與相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果[12-13]相似，提示成功建立心肌細(xì)胞氧化損傷模型。本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，circPRKCI過表達(dá)可降低H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中MDA含量，增強(qiáng)SOD、GSH-Px活性，提示circPRKCI過表達(dá)可抑制氧化應(yīng)激，從而減輕H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷。氧自由基生成量增加可激活線粒體凋亡途徑，其中Bcl-2表達(dá)水平降低，而Bax表達(dá)水平升高，通過激活Caspase-3從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14-15]。本研究結(jié)果顯示，H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白水平降低，Bax蛋白水平升高，circPRKCI過表達(dá)可降低H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率，并可抑制Bax表達(dá)及促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，提示circPRKCI過表達(dá)可抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而減輕心肌細(xì)胞氧化損傷。

本研究結(jié)果還證實(shí)circPRKCI可充當(dāng)miR-217的海綿分子，并負(fù)向調(diào)控miR-217表達(dá)及活性。抑制miR-217表達(dá)可通過恢復(fù)張力蛋白同源物(PTEN)介導(dǎo)的自噬途徑減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷[16]。miR-217通過靶向磷酸酯酶與PTEN促進(jìn)心臟肥大和功能障礙[17]。miR-217表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡[18]。本研究結(jié)果顯示，H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞miR-217表達(dá)水平升高，抑制miR-217表達(dá)可明顯降低MDA含量，增強(qiáng)SOD、GSH-Px活性，并降低細(xì)胞凋亡率，提示抑制miR-217表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力及抑制細(xì)胞凋亡，從而減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，circPRKCI過表達(dá)與miR-217過表達(dá)聯(lián)合處理可提高M(jìn)DA含量，減低SOD、GSH-Px活性，并提高細(xì)胞凋亡率，提示miR-217過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)circPRKCI過表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡作用。

綜上所述，H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中circPRKCI表達(dá)水平降低，而miR-217表達(dá)水平升高，circPRKCI過表達(dá)通過下調(diào)miR-217表達(dá)抑制氧化應(yīng)激及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而減輕心肌細(xì)胞氧化損傷，circPRKCI/miR-217可能作為心肌缺血再灌注損傷的治療靶點(diǎn)，但具體作用機(jī)制需進(jìn)一步分析。