宣學(xué)習(xí)，張 宇，張 華，張傳西，袁義強

冠心病是一種常見的心血管疾病，其降壓治療復(fù)雜，無論血壓是否達(dá)到高血壓標(biāo)準(zhǔn)[>140/90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)]，均需應(yīng)用降壓藥，且需避免血壓過低[1]。另外，冠心病可導(dǎo)致機體出現(xiàn)血流動力學(xué)改變，引發(fā)血管重塑，增加心、腎、腦等重要臟器損害發(fā)生風(fēng)險，且與血壓變化密切相關(guān)，使得降壓藥物選擇難度大[2-3]。因此，選擇恰當(dāng)降壓藥物，緩解或逆轉(zhuǎn)冠心病病人血管重塑，維持血壓穩(wěn)定，對減少重要臟器損傷具有重要意義。復(fù)方七芍降壓片為高血壓治療經(jīng)驗方，可化瘀息風(fēng)、養(yǎng)陰柔肝。有學(xué)者提出，復(fù)方七芍降壓片不僅能控制血壓，還可改善主動脈血管重塑，但作用機制尚不明確[4]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)為鋅依賴性蛋白水解酶家族的一類，其中MMP-2在心臟及主動脈重塑中發(fā)揮重要作用，是評價血管重塑的生物標(biāo)志物之一[5]?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-2(tissue inhibitor of metalloproteinases-2，TIMP-2)可結(jié)合MMP-2，增加主動脈、腦血管內(nèi)膠原蛋白堆積，誘發(fā)重塑[6]。既往報道指出，MMP-2/TIMP-2信號通路激活，可能是引發(fā)血管重塑的一個關(guān)鍵因素[7]。本研究旨在觀察復(fù)方七芍降壓片對冠心病大鼠血管重塑、動態(tài)血壓的影響并分析其作用機制，為冠心病康復(fù)治療提供理論依據(jù)及方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 60只清潔級健康雄性SD大鼠，購自北京科興生物制品有限公司，許可證號：SYXK(京)2019-0053，7周齡，體質(zhì)量(300±20)g。給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水喂養(yǎng)，12 h/12 h晝夜周期照明，環(huán)境溫度(22±2)℃，濕度55%。本研究經(jīng)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 藥物、試劑和儀器 復(fù)方七芍降壓片[湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科(壓片前狀態(tài))，批號：160416]，卡托普利片(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：1712108)，戊巴比妥鈉(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，批號：181208)。白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(北京東亞生物技術(shù)研究所)，兔抗大鼠MMP-2、TIMP-2一抗及山羊抗兔二抗IgG(美國Cell Signaling Technology公司)，丙二醛(malonaldehyde，MDA)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)。BP-2010A小動物無創(chuàng)血壓儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，5417R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，AU-5421型全自動生化儀(美國Beckman Coulter公司)，IX71型倒置顯微鏡及照相裝置(日本Olympus公司)，GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)(美國BioRAD公司)，Multiskan型酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及分組 大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機取10只作為空白對照組(A組)，另外50只參照文獻(xiàn)[8]采用冠狀動脈結(jié)扎法建立冠心病大鼠模型。大鼠以2%戊巴比妥鈉50 mg/kg(0.25 mL/100 g)腹腔注射麻醉，固定在手術(shù)臺上，氣管插管，連接人工動物呼吸機進(jìn)行呼吸支持。于胸骨左側(cè)第3肋、第4肋間正中線作5 mm縱形切口，在心臟左心耳根旁下2～3 mm處穿線，冠狀動脈左前降支結(jié)扎，建立心肌缺血模型。完成結(jié)扎后，快速還納心臟，關(guān)閉胸腔，恢復(fù)自主呼吸。建模成功標(biāo)準(zhǔn)為術(shù)后Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段弓背向上抬高。50只大鼠建模成功44只，成功率88.00%。將44只大鼠隨機分為模型組(B組)、卡托普利組(C組)、復(fù)方七芍降壓片低劑量組(D組)、復(fù)方七芍降壓片高劑量組(E組)，各11只。A組不結(jié)扎冠狀動脈左前降支，其余步驟同上，10只大鼠均未死亡，納入研究。

1.2.2 干預(yù)方法 建模成功1周后開始灌胃，按照《藥理實驗方法學(xué)》[9]中成人(70 kg)與大鼠(200 g)間體表面積換算公式給藥。復(fù)方七芍降壓片(壓片前)灌胃前用蒸餾水配制成濃度為2 mL混懸液，成人每日用量49 g，D組以成人等效量灌胃，即4.41 g/(kg·d)，給藥量10 mL/kg，每日1次，連續(xù)4周；E組以成人等效量2.0倍灌胃，即8.82 g/(kg·d)，給藥量10 mL/kg，每日1次，連續(xù)4周?？ㄍ衅绽辔盖坝谜麴s水配制成濃度為2 mL混懸液，成人每日用量75 mg，以成人等效量灌胃，即6.75 mg/(kg·d)，給藥量10 mL/kg，每日1次，連續(xù)4周。A組、B組以2 mL蒸餾水灌胃，給藥量為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)4周。期間各組大鼠每周測量1次血壓。

1.2.3 無創(chuàng)血壓儀檢測動態(tài)血壓 分別在治療1周、2周、3周、4周時，采用尾動脈測壓法檢測各組大鼠動態(tài)血壓。經(jīng)尾袖法連接小動物無創(chuàng)血壓儀，檢測尾動脈舒張壓、收縮壓，各測3次，取平均值。測壓時間段加溫，以大鼠尾動脈有搏動信號為佳，并注意動作輕柔，避免激惹大鼠，影響血壓測量。

1.2.4 樣本取材、處理 末次給藥并檢測動態(tài)血壓后，以2%戊巴比妥鈉50 mg/kg(0.25 mL/100 g)腹腔注射麻醉，手術(shù)臺上固定。頸動脈放血處死，快速取出胸主動脈，分為4份。其中3份置于液氮保存，以備檢測炎癥指標(biāo)、氧化應(yīng)激指標(biāo)及MMP-2、TIMP-2蛋白表達(dá)；1份置于4%多聚甲醛固定，以備檢測血管重塑參數(shù)。

1.2.5 ELISA法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α水平 取液氮保存的胸主動脈組織，經(jīng)生理鹽水，冰浴下制備10%組織勻漿。4 ℃、10 000 r/min離心，離心半徑8 cm，共10 min，取上清液。采用ELISA法檢測IL-lβ、IL-6、TNF-α水平，嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。將不同程度標(biāo)準(zhǔn)品100 μL、標(biāo)本100 μL加入相應(yīng)反應(yīng)孔，混勻，37 ℃溫育2 h。板內(nèi)液體甩干，洗滌4～6次，濾紙上印干；以100 μL一抗工作液加入各孔，混勻，37 ℃溫育，共1 h，甩干，洗滌4～6次，濾紙上印干；以100 μL酶標(biāo)工作液加入各孔，混勻，37 ℃溫育，共30 min，甩干，洗滌4～6次，濾紙上印干；以100 μL底物工作液加入各孔，混勻，37 ℃溫育，共15 min；各孔加入100 μL終止液，混勻，反應(yīng)10 min，觀察酶標(biāo)儀450 nm處吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)本吸光值獲得濃度。

1.2.6 ELISA法檢測ROS、MDA水平 取液氮保存的胸主動脈組織，經(jīng)生理鹽水，冰浴下制備10%組織勻漿。4 ℃、10 000 r/min離心，離心半徑8 cm，共10 min，取上清液。以純化的大鼠ROS抗體包被微孔板，制成固相抗體，包被一抗的微孔內(nèi)依次加入ROS，37 ℃溫育2 h。完成溫育后，抗ROS抗體結(jié)合鏈霉親和素-HRP，形成免疫復(fù)合物，溫育，洗滌，加入底物工作液，觀察顏色變化，顏色深淺與樣本中ROS濃度呈正相關(guān)。酶標(biāo)孔加入50 μL終止液，反應(yīng)10 min，隨后酶標(biāo)儀空白孔調(diào)零，于酶標(biāo)儀450 nm波長處，對各孔吸光值進(jìn)行測量。以吸光值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)本吸光值獲得濃度。同樣方法檢測MDA水平。

1.2.7 HE染色法觀察血管重塑參數(shù) 取4%多聚甲醛固定的胸主動脈組織，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片，厚度4 μm。進(jìn)行HE染色，中性樹膠封片，圖像分析應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0系統(tǒng)軟件。顯微鏡下(×400)觀察胸主動脈組織形態(tài)學(xué)變化，拍攝照片。檢測并記錄血管重塑參數(shù)，包括中膜厚度(media thickness，MT)、管腔內(nèi)徑(lumen diameter，LD)，分別自順時針方向連續(xù)檢測12個值，取平均值；計算MT/LD。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測MMP-2、TIMP-2蛋白相對表達(dá)量 取液氮保存的胸主動脈組織，根據(jù)質(zhì)量體積比1∶9添加勻漿液，制備勻漿。以等體積2×上樣緩沖液加入，煮沸，共10 min，蛋白變性。4 ℃、12 000 r/min離心，離心半徑8 cm，共5 min，取上清液，樣品蛋白濃度以BCA法檢測。采用上樣緩沖液，對蛋白濃度進(jìn)行調(diào)整，保持各泳道蛋白上樣體積10 μL。聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜，脫脂奶粉封閉，洗脫。加入MMP-2、TIMP-2一抗(1∶100)，4 ℃孵育，過夜；隨后加入山羊抗兔二抗IgG(1∶2 500)，搖床，孵育，共2 h。經(jīng)ECL包裝、顯影、照相，以Quantity One軟件分析灰度值，蛋白相對含量采用各蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值計算。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血壓比較 治療1周、2周、3周、4周時，各組收縮壓、舒張壓比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與A組比較，B組各時段收縮壓、舒張壓均升高(P<0.05)；與B組比較，C組、D組、E組各時段收縮壓、舒張壓均降低(P<0.05)；與D組比較，C組、E組各時段收縮壓、舒張壓均降低(P<0.05)；E組與C組收縮壓、舒張壓比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1、表2。

表1 各組大鼠收縮壓比較 (±s) 單位：mmHg

表2 各組大鼠舒張壓比較 (±s) 單位：mmHg

2.2 各組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 各組IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與A組比較，B組IL-1β、IL-6、TNF-α水平均升高(P<0.05)；與B組比較，C組、D組、E組IL-1β、IL-6、TNF-α水平均降低(P<0.05)；與D組比較，C組、E組IL-1β、IL-6、TNF-α水平均降低(P<0.05)；E組與C組IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 (±s) 單位：pg/mL

2.3 各組大鼠ROS、MDA水平比較 各組ROS、MDA水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與A組比較，B組ROS、MDA水平均升高(P<0.05)；與B組比較，C組、D組、E組ROS、MDA水平均降低(P<0.05)；與D組比較，C組、E組ROS、MDA水平均降低(P<0.05)；E組與C組ROS、MDA水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠ROS、MDA水平比較(±s)

2.4 各組胸主動脈組織形態(tài)學(xué)變化 HE染色顯示，A組大鼠胸主動脈管壁內(nèi)皮較完整，未出現(xiàn)增生現(xiàn)象，中膜平滑肌有序排列，彈性纖維清晰。B組大鼠胸主動脈管壁厚度增加，內(nèi)皮不完整，明顯增厚，中膜平滑肌細(xì)胞排列較紊亂，彈性纖維稍增多，紋絡(luò)不清晰。D組內(nèi)皮增生程度減輕，部分平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜下增生遷移，彈性纖維稍增多。C組、E組管壁無明顯增厚，可見輕度內(nèi)皮增生增厚，中膜平滑肌層、彈性纖維無明顯病理改變，較D組改善更明顯。詳見圖1。

圖1 各組大鼠胸主動脈組織形態(tài)學(xué)變化(×400)

2.5 各組大鼠血管重塑形態(tài)學(xué)參數(shù)比較 各組大鼠MT、LD、MT/LD比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與A組比較，B組MT、MT/LD升高，LD降低(P<0.05)；與B組比較，C組、D組、E組MT、MT/LD降低，LD升高(P<0.05)；與D組比較，C組、E組MT、MT/LD降低，LD升高(P<0.05)；E組與C組MT、LD、MT/LD比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表5。

表5 各組MT、LD、MT/LD比較 (±s)

2.6 各組MMP-2、TIMP-2蛋白相對表達(dá)量比較 各組MMP-2、TIMP-2蛋白相對表達(dá)量及MMP-2/TIMP-2比值比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與A組比較，B組MMP-2蛋白相對表達(dá)量、MMP-2/TIMP-2比值均升高，TIMP-2蛋白相對表達(dá)量降低(P<0.05)；與B組比較，C組、D組、E組MMP-2蛋白相對表達(dá)量、MMP-2/TIMP-2比值降低，TIMP-2蛋白相對表達(dá)量升高(P<0.05)；與D組相比，C組、E組MMP-2蛋白相對表達(dá)量、MMP-2/TIMP-2比值降低，TIMP-2蛋白相對表達(dá)量升高(P<0.05)；E組與C組MMP-2、TIMP-2蛋白相對表達(dá)量及MMP-2/TIMP-2比值比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表6、圖2。

表6 各組MMP-2、TIMP-2蛋白相對表達(dá)量及MMP-2/TIMP-2比較 (±s)

圖2 各組MMP-2、TIMP-2蛋白灰度值

3 討 論

冠心病為臨床常見病、多發(fā)病，血管重塑為該病重要的病理改變之一，且為致使病情發(fā)展、惡化的關(guān)鍵。冠心病血管重塑主要是由機體血流動力學(xué)變化、局部生長因子形成等引發(fā)的血管結(jié)構(gòu)、功能變化，可造成血壓波動，且與降壓治療密切相關(guān)[10]。既往冠心病降壓多應(yīng)用鈣通道阻滯劑、β受體阻滯劑等藥物，但也存在耐藥性、副作用等問題，而中醫(yī)藥在冠心病及其并發(fā)癥防治中有獨特價值。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，冠心病屬于“心痛”“胸痹”等范疇，病因病機為血行不暢，血瘀內(nèi)生，脈絡(luò)瘀阻，阻礙氣機，引發(fā)氣滯；瘀血內(nèi)阻，脈絡(luò)不通，不通則痛，新血不生，不榮則痛，故氣滯血瘀貫穿冠心病始終[11]。復(fù)方七芍降壓片是一種中藥復(fù)方制劑，包括三七、白芍、桑寄生、地龍、杜仲等，可化瘀息風(fēng)、養(yǎng)陰柔肝，使陰虛得補，陽亢得平，脈絡(luò)得暢，清竅得養(yǎng)，眩暈得止[12-13]。既往研究指出，復(fù)方七芍降壓片具有良好降壓效果，可改善血管內(nèi)皮功能，延緩血管重塑，但其作用機制尚不明確[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，C組、D組、E組治療各時段收縮壓、舒張壓均較B組降低，且MT、MT/LD均低于B組，LD高于B組，其中E組效果與C組相當(dāng)；進(jìn)一步分析胸主動脈形態(tài)學(xué)改變，結(jié)果顯示，與B組相比，C組、E組管壁無明顯增厚，可見輕度內(nèi)皮增生增厚，中膜平滑肌層、彈性纖維無明顯病理改變，且較D組改善更明顯，說明復(fù)方七芍降壓片可改善冠心病大鼠血管重塑，穩(wěn)定動態(tài)血壓。IL-1、TNF-α等炎性因子與心血管重塑密切相關(guān)。動物實驗發(fā)現(xiàn)，TNF-α可促進(jìn)自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖，增加動脈壁厚度，引發(fā)血管重塑[15]。冠心病、心力衰竭等疾病中，氧化應(yīng)激也是引發(fā)血管重塑的一個重要因素[16]。本研究檢測各組IL-1β、TNF-α、MDA、ROS表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，復(fù)方七芍降壓片可劑量依賴性降低冠心病大鼠IL-1β、TNF-α、MDA、ROS表達(dá)水平，提示復(fù)方七芍降壓片可減輕氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，發(fā)揮改善血管重塑的作用。

本研究還分析了復(fù)方七芍降壓片改善冠心病大鼠血管重塑、動態(tài)血壓的可能機制。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，MMP-2、TIMP-2在多種因素所致血管損傷重塑過程中發(fā)揮重要作用，MMP-2/TIMP-2為血管重塑調(diào)節(jié)重要信號通路之一，其激活可引發(fā)細(xì)胞炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成細(xì)胞損傷[17]。機體血管損傷初期，可導(dǎo)致MMP-2表達(dá)提升，誘發(fā)增生性修復(fù)重塑，同時TIMP-2抑制MMP-2活性作用逐漸增加，可相應(yīng)減弱重塑作用[18]。相關(guān)動物實驗發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)MMP-2/TIMP-2蛋白表達(dá)，是藥物治療改善自發(fā)性高血壓大鼠血管重塑的作用機制之一[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與A組相比，B組MMP-2蛋白相對表達(dá)量升高，TIMP-2蛋白相對表達(dá)量下降，MMP-2/TIMP-2比值增大，說明冠心病大鼠存在MMP-2/TIMP-2信號通路激活，與血管重塑、血壓波動密切相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，復(fù)方七芍降壓片可劑量依賴性調(diào)節(jié)冠心病大鼠MMP-2、TIMP-2蛋白表達(dá)，抑制MMP-2/TIMP-2信號通路，這可能是其改善血管重塑、動態(tài)血壓的一個重要作用機制。說明復(fù)方七芍降壓片可改善冠心病大鼠血管重塑，降低血壓水平，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)，作用機制可能與抑制MMP-2/TIMP-2信號通路激活有關(guān)。

綜上所述，復(fù)方七芍降壓片可改善冠心病大鼠血管重塑，維持動態(tài)血壓穩(wěn)定，減輕氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，作用機制可能與抑制MMP-2/TIMP-2信號通路有關(guān)。然而，鑒于復(fù)方七芍降壓片具有較多藥理活性，故其改善血管重塑、降壓的其他機制仍有待進(jìn)一步探討。