孟勝喜，陳慧澤，劉 雨，王 兵，李文濤，潘衛(wèi)東，張?jiān)圃?/p>

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，其特征為β淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)以老年斑的形式在細(xì)胞外的蓄積和過度磷酸化tau蛋白以神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形式在細(xì)胞內(nèi)蓄積，從而呈現(xiàn)進(jìn)行性神經(jīng)元丟失和腦萎縮[1-5]。AD嚴(yán)重威脅病人的日常生活質(zhì)量，給病人家庭和社會帶來了沉重的照顧負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前還沒有改善AD的有效治療方法[6]。中醫(yī)藥在防治AD方面發(fā)揮著不可替代的作用，其優(yōu)勢也逐漸被重視和關(guān)注[7]。恒清Ⅱ號方(HQ)是本課題組長期用于臨床防治AD療效確切的經(jīng)驗(yàn)方，前期做過大量相關(guān)的臨床試驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)研究，已經(jīng)驗(yàn)證了恒清Ⅱ號方對于AD具有確切的療效[8-11]，且已申請了國家專利(專利號：201910371018.5)，但是其作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究。鑒于此，本研究以淀粉樣前體蛋白(APP)/早老素1(PS1)小鼠為AD動物模型，探討恒清Ⅱ號方對其作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性24周齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，體質(zhì)量(27±2)g，無特定病原體(SPF)級，由南京大學(xué)模式動物研究所提供，許可證號：SCXK(蘇)2010-0001；雄性24周齡C57BL/6小鼠，體質(zhì)量(26±3)g，SPF級，購買于上海靈暢生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2018-003。

1.2 藥物、試劑與儀器

1.2.1 藥物 恒清Ⅱ號方組成：益智仁30 g，黃芪15 g，菟絲子10 g，川芎10 g，熟地黃15 g，桑寄生10 g，煅石決明10 g，杜仲10 g，地龍10 g，天麻10 g，鉤藤10 g。由上海市第六人民醫(yī)院中藥房提供。按以上恒清Ⅱ號方處方比例稱取全部藥材，加入10倍量的水浸泡0.5 h，煎煮3次，每次40 min，過濾，合并以上3次濾液，在37 ℃水浴中加熱濃縮，根據(jù)臨床實(shí)際用藥情況，對所得藥液進(jìn)行濃縮處理，濃縮至0.535 g/mL匹配臨床的實(shí)際用藥濃度，置于4 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 主要試劑與儀器 PI3 Kinase p85(19H8)Rabbit mAb(CST公司，美國)，Akt Antibody(CST公司，美國)，Phospho-Akt(Ser473)(D9E)XP?Rabbit mAb(CST公司，美國)，mTOR(S2442)polyclonal antibody(Bioworlde公司，美國)，Phospho-mTOR(Ser2448)(D9C2)XP?Rabbit mAb(CST公司，美國)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(P0012S，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國)，anti-β-actin(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國)，二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國)。Morris全自動水迷宮測試系統(tǒng)購自上海吉量軟件科技有限公司(型號：JLBehv-MWMG-1)。

1.3 分組及給藥 按照隨機(jī)數(shù)字表法將20只雄性24周齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為模型組、HQ 組，每組10只，同時(shí)另設(shè)立同周齡、同背景的C57BL/6小鼠10只為正常對照組。HQ 組小鼠每天給予HQ 40 mg/kg灌胃，正常對照組和模型組小鼠給予等體積的生理鹽水灌胃，均為每日1次，連續(xù)灌胃8周。然后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評價(jià)APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶能力與空間位置認(rèn)知能力 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行5 d，前4 d(定位航行實(shí)驗(yàn))將實(shí)驗(yàn)小鼠分別從3個(gè)不同的入水點(diǎn)面朝池壁依次置于水中，依次記錄每只小鼠的逃避潛伏期(escape latencies，EL)、游泳路徑長度。第5天(空間探索實(shí)驗(yàn))，先撤去平臺，將小鼠于同樣的3個(gè)入水點(diǎn)依次置于水中，依次記錄小鼠在90 s內(nèi)跨越平臺的次數(shù)(number of cross-platform，NCP)[12]。計(jì)算機(jī)攝像系統(tǒng)自動監(jiān)測Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)水池中的小鼠游泳情況，然后采用軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.4.2 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測小鼠海馬組織磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide3-kinases，PI3K)、蛋白激酶 B(protein kinase B，Akt)、磷酸化蛋白激酶 B(p-Akt)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)的蛋白表達(dá)水平 灌胃8 周后，用0.3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，斷頭，冰盤上開顱取腦，分離海馬組織，-80 ℃冰箱保存。檢測時(shí)取出小鼠海馬組織，加RIPA裂解緩沖液，研磨均勻，冰上30 min，取上層液，4 ℃離心15 min(12 000 r/min)，提取總蛋白，測蛋白濃度。每組蛋白上樣40～60 μg，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，過夜后，二抗孵育，掃描，圖像導(dǎo)出，采用Image J軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 第1天至第4天，與正常對照組比較，模型組小鼠的EL均明顯延長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；第1天、第2天，與模型組比較，HQ 組小鼠EL均縮短，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第3天、第4天，與模型組比較，HQ 組小鼠EL均明顯縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見表1。

表1 各組小鼠EL比較 (±s) 單位：s

第1天至第4天，與正常對照組比較，模型組小鼠的定位航行路徑長度均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；第1天、第2天，與模型組比較，HQ組小鼠定位航行路徑長度縮短，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第3天、第4天，與模型組比較，HQ 組小鼠定位航行路徑長度均明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見表2。

表2 各組小鼠定位航行路徑長度比較 (±s) 單位：m

2.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 與正常對照組比較，模型組小鼠NCP明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，HQ 組小鼠NCP明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見表3。

表3 各組小鼠NCP比較(±s) 單位：次

2.2 各組小鼠海馬組織PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)水平比較 與正常對照組比較，模型組小鼠海馬組織 PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，HQ組小鼠PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見圖1、表4。

圖1 各組小鼠海馬組織PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)(1為正常對照組；2為模型組；3為HQ組)

表4 各組小鼠海馬組織PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)水平比較 (±s)

3 討 論

自噬可減少Tau蛋白的過度磷酸化延緩AD進(jìn)展。在AD病人中線粒體自噬增加，自噬與神經(jīng)炎性反應(yīng)之間有著密切的聯(lián)系。目前已知PI3K/Akt/mTOR是細(xì)胞自噬的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其通過調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的凋亡和自噬管理著細(xì)胞的存活。抑制PI3K/Akt/mTOR則可以誘導(dǎo)自噬，而自噬可能對細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。PI3K/Akt/mTOR信號通路異常激活與AD的病理學(xué)改變有關(guān)[13]。PI3K和其下游分子Akt所構(gòu)成的信號途徑作為一個(gè)經(jīng)典抗凋亡、促存活的信號傳導(dǎo)途徑，通過激活下游mTOR來調(diào)節(jié)自噬[14]；PI3K的下游直接靶點(diǎn)蛋白Akt調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和存活，PI3K的激活可使Akt磷酸化[15]，而激活后的Akt蛋白可以啟動通路下游的級聯(lián)反應(yīng)，可以進(jìn)一步磷酸化一系列下游底物，通過多種機(jī)制促細(xì)胞存活、抗細(xì)胞凋亡[16]；mTOR是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，是控制細(xì)胞生長、增殖、代謝和凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物[17]，也是PI3K信號通路下游分子之一。

AD在中醫(yī)學(xué)中屬“呆病”“善忘”“癡呆”“健忘”等范疇。清代醫(yī)家王清任在《醫(yī)林改錯(cuò)·腦髓說》提出，腎虛、腦髓失養(yǎng)是本病的主要病因?！秱摗返摹捌淙松仆撸赜行钛币约扒迥┟t(yī)唐容川的 “凡心有瘀血，亦令健忘”“血在上，則濁蔽不明矣”(《血證論》)，均提示瘀血是癡呆的重要形成因素。明代醫(yī)藥學(xué)家李時(shí)珍的“痰生百病”(《頻湖脈學(xué)》)，痰迷神竅可致癡呆。清代醫(yī)家陳士鐸的“治呆無奇法，治痰即治呆”(《辨證錄》)。 痰飲和瘀血相互影響，痰可致瘀，瘀也可成痰。痰瘀互結(jié)，元神失養(yǎng)，則生本病。因此，AD的病機(jī)根本為腎虛，病機(jī)關(guān)鍵在痰瘀，治療上應(yīng)以補(bǔ)腎為主，輔以化痰祛瘀。恒清Ⅱ號方是本課題組根據(jù)長期臨床觀察總結(jié)而來的治療AD的經(jīng)驗(yàn)效方，全方具有補(bǔ)腎、化痰祛瘀的作用，從而治療AD[8-11]。

益智仁的主要成分諾卡酮對腦室內(nèi)注射脂多糖(LPS)誘發(fā)的AD小鼠模型具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用[18]。黃芪的主要成分黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ， AS-Ⅳ)作為一種天然的過氧化物酶體增殖活化受體(PPARγ)可抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的APP/PS1小鼠的記憶障礙和海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，可能是通過促進(jìn)PPARγ/腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)信號通路而引起的[19]，也可以減輕Aβ1-42誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)開放[20-21]。菟絲子提取物可以改善衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[22]。川芎揮發(fā)油中的主要成分丁基苯酞?jiǎng)t可通過調(diào)節(jié)Akt、 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)信號通路等[23]，從而抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡、抗腦缺氧、增強(qiáng)認(rèn)知能力等。熟地黃可抑制血漿皮質(zhì)醇含量和海馬糖皮質(zhì)激素受體mRNA表達(dá)，提高學(xué)習(xí)記憶能力，上調(diào)海馬神經(jīng)生長因子、c-fos的基因表達(dá)[24]。小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和被動回避實(shí)驗(yàn)表明桑寄生可以逆轉(zhuǎn)東莨菪堿所致的記憶障礙[25]。牡蠣水提液可以延緩去卵巢大鼠腦衰老[26]。杜仲對受到脂多糖刺激的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞BV-2具有抗炎活性[27]。地龍?zhí)崛∫嚎汕宄?MDA)、超氧化物歧化酶，阻斷Ca2+內(nèi)流，保護(hù)缺血再灌流損傷[28]。天麻的主要有效成分巴利森苷C可以改善Aβ1-42誘導(dǎo)的大鼠腦損害后長時(shí)程增強(qiáng)抑制，調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體介導(dǎo)電流[29]。鉤藤水提物、異鉤藤堿可以改善Aβ蛋白變性導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷[30]。

本研究結(jié)果顯示，第1天至第4天，與模型組比較，恒清Ⅱ號方組小鼠EL、定位航行路徑長度均明顯縮短，NCP明顯增加(P<0.01)，表明恒清Ⅱ號方可以明顯改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。與正常對照組比較，模型組小鼠的海馬腦區(qū)PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，HQ組小鼠的海馬腦區(qū)PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05)，其中，不僅Akt和mTOR總量表達(dá)下降，p-Akt和p-mTOR水平也明顯降低，表明自噬效應(yīng)明顯增強(qiáng)。表明恒清Ⅱ號方可以有效抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，Western Blot檢測結(jié)果也表明自噬現(xiàn)象明顯增強(qiáng)。說明恒清Ⅱ號方可以抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，增強(qiáng)自噬。

綜上所述，恒清Ⅱ號方可以改善APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，可能是通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路、增強(qiáng)自噬而發(fā)揮抗AD作用的。