趙瑞彪，單會(huì)艷，俞艷華

心肌梗死是臨床常見(jiàn)的心血管疾病，近年來(lái)，心肌梗死發(fā)病率與死亡率逐年上升，已嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量，非編碼RNA屬于組織特異性的RNA分子，其具有高度保守性，并可調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡等過(guò)程從而參與心血管疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，其中，微小RNA(miRNA)與長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)在心血管疾病中表達(dá)異常，并可能作為減輕心肌細(xì)胞損傷的治療靶點(diǎn)[1-5]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA SNHG7(LncRNA SNHG7)在骨關(guān)節(jié)炎中表達(dá)水平降低，上調(diào)其表達(dá)可抑制軟骨細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞增殖[6]。但SNHG7在小鼠心肌梗死后心肌細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制尚未闡明。本研究旨在探討SNHG7過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡及炎癥損傷的影響及其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 40只無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)C57BL/6雄性小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，12周齡，死亡4只，剩余36只，動(dòng)物許可證號(hào)SXCK(京)：2016-0008。大鼠心肌細(xì)胞H9C2購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miR-223 mimics、miR-NC、si-NC、si-SNHG7購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Trizol、cDNA合成、熒光定量購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；兔抗鼠脂肪酸合成酶(Fas)、Cleaved Caspase-3抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 建立小鼠心肌梗死模型 采用2%水合氯醛(100 mg/kg)麻醉小鼠，切開(kāi)氣管，使用呼吸機(jī)輔助呼吸(7～8 mL)，120次/min，呼吸比1∶2，在第4肋間入胸，識(shí)別前降支走行范圍，采用滑線(xiàn)(7/0)結(jié)扎前降支，同時(shí)進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色與Masson染色，觀察小鼠心電圖示波，若左心室前壁部分顏色轉(zhuǎn)為蒼白且具有心肌梗死的臨床表現(xiàn)時(shí)則視為模型制作成功[7]。1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 采用慢病毒方法構(gòu)建攜帶SNHG7過(guò)表達(dá)的慢病毒與攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的慢病毒空載體[8]。36只小鼠隨機(jī)選取9只作為假手術(shù)組(小鼠僅開(kāi)胸，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈)，其余27只小鼠均進(jìn)行造模，隨機(jī)分為模型組、空載組與SNHG7過(guò)表達(dá)組，每組9只?？蛰d組攜帶GFP的慢病毒空載體(4×107TU)進(jìn)行心肌組織局部注射轉(zhuǎn)染，SNHG7過(guò)表達(dá)組攜帶SNHG7過(guò)表達(dá)的慢病毒(4×107TU)進(jìn)行心肌組織局部注射轉(zhuǎn)染。各組培養(yǎng)24 h后，采用10%水合氯醛麻醉小鼠，切取遠(yuǎn)端缺血心肌組織，置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。

1.2.3 缺氧/缺血誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型 H9C2細(xì)胞正常培養(yǎng)，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)液更換為不含血清的培養(yǎng)基，首先置于缺氧罐內(nèi)，同時(shí)在其中放置Genbox厭氧產(chǎn)氣包，制備缺血/缺氧模型，將缺氧罐置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究[9]。將正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞作為Con組，將缺氧缺血處理的心肌細(xì)胞作為缺氧組。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)SNHG7、miR-223與腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β) mRNA的表達(dá)水平 采用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)SNHG7、miR-223與TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.5 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取心肌組織，常規(guī)脫蠟處理制備石蠟切片(5 μm)，經(jīng)過(guò)不同濃度的乙醇浸洗，滴加蛋白酶K溶液，室溫孵育，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，滴加50 μL TUNEL反應(yīng)液，室溫孵育1 h，PBS洗滌，滴加過(guò)氧化氫10 min，PBS洗滌，滴加底物二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物溶液(50 μL)，室溫孵育10 min，PBS洗滌，加入DIPA，采用抗熒光淬滅劑封片，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察與藍(lán)色細(xì)胞核重疊的綠色熒光為凋亡細(xì)胞，凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)SNHG7與miR-223的靶向關(guān)系 LncBase v.2預(yù)測(cè)顯示SNHG7與miR-223存在結(jié)合位點(diǎn)，分別構(gòu)建野生型載體WT-SNHG7與突變型載體MUT-SNHG7，分別將miR-NC、miR-223 mimics與WT-SNHG7、MUT-SNHG7共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，檢測(cè)各組相對(duì)熒光素酶活性。分別將pcDNA、pcDNA-SNHG7、si-NC、si-SNHG7轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，采用qRT-PCR檢測(cè)miR-223的表達(dá)量。

1.2.7 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)Fas、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá) 心肌組織加入500 μL RIPA裂解液提取總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉2 h，孵育一抗稀釋液與二抗稀釋液，化學(xué)發(fā)光加強(qiáng)法(ECL)顯影，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。Fas、Cleaved Caspase-3一抗稀釋比為1∶1 000，二抗稀釋比為1∶2 000，F(xiàn)as、Cleaved Caspase-3以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參計(jì)算Fas、Cleaved Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色與Masson染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌細(xì)胞肥大，排列紊亂，血管增生，細(xì)胞間質(zhì)增寬；Masson染色結(jié)果顯示，模型組大鼠出現(xiàn)組織纖維化，不定性膠原纖維組織增生。詳見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色與Masson染色結(jié)果

2.2 各組大鼠SNHG7表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組SNHG7表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組、空載組比較，SNHG7過(guò)表達(dá)組SNHG7表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠SNHG7表達(dá)水平比較(±s)

2.3 SNHG7過(guò)表達(dá)對(duì)大鼠心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡及Fas、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組凋亡指數(shù)及Fas、Cleaved Caspase-3蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與模型組、空載組比較，SNHG7過(guò)表達(dá)組凋亡指數(shù)及Fas、Cleaved Caspase-3蛋白水平明顯降低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖2、表3。

圖2 Western Blot法檢測(cè)Fas、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)電泳圖

表3 SNHG7過(guò)表達(dá)對(duì)大鼠心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡及Fas、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 (±s)

2.4 SNHG7過(guò)表達(dá)對(duì)大鼠心肌梗死后心肌細(xì)胞炎性因子mRNA表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組、空載組比較，SNHG7過(guò)表達(dá)組TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表4。

表4 SNHG7過(guò)表達(dá)對(duì)大鼠心肌梗死后心肌細(xì)胞炎性因子mRNA表達(dá)的影響 (±s)

2.5 缺氧/缺血誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中SNHG7與miR-223的表達(dá)水平 與Con組比較，缺氧組SNHG7表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，miR-223表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表5。

表5 缺氧/缺血誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中SNHG7與miR-223的表達(dá)水平 (±s)

2.6 SNHG7靶向調(diào)控miR-223 LncBase v.2預(yù)測(cè)顯示，SNHG7與miR-223存在結(jié)合位點(diǎn)，詳見(jiàn)圖3。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-223過(guò)表達(dá)可抑制野生型WT-SNHG7轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性(P<0.05)，但其對(duì)突變型MUT-SNHG7轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性無(wú)明顯影響(P>0.05)，詳見(jiàn)表6。與pcDNA組比較，pcDNA-SNHG7組miR-223表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與si-NC組比較，si-SNHG7組miR-223表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表7。

圖3 SNHG7的序列中含有與miR-223p互補(bǔ)的核苷酸序列

表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(±s)

表7 SNHG7靶向調(diào)控miR-223的表達(dá)(±s)

3 討 論

LncRNA可參與心肌梗死等心血管疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡等生物學(xué)過(guò)程，并可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA而負(fù)向調(diào)控其表達(dá)從而參與細(xì)胞凋亡等過(guò)程[10-12]。但仍有部分LncRNA在心肌梗死后心肌細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制尚未闡明。

SNHG7在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、卵巢癌、宮頸癌等腫瘤中表達(dá)水平升高，并可促進(jìn)腫瘤發(fā)生及發(fā)展[13-15]。但SNHG7在心肌梗死中的表達(dá)及其可能作用機(jī)制尚未闡明。本研究結(jié)果顯示，心肌梗死模型組小鼠心肌組織中SNHG7的表達(dá)水平降低，而SNHG7過(guò)表達(dá)組SNHG7的表達(dá)水平明顯升高，提示SNHG7在心肌梗死發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。心肌梗死發(fā)生后可加重心肌損傷，其中，心肌細(xì)胞凋亡是加重心肌損傷的重要原因，因此，減少心肌細(xì)胞凋亡成為減輕心肌損傷的重要措施，細(xì)胞凋亡過(guò)程與 Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)密切相關(guān)，Caspase-3屬于凋亡執(zhí)行因子，凋亡過(guò)程中Caspase-3被激活形成Cleaved Caspase-3，Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平可反映細(xì)胞凋亡情況，而Fas基因被活性氧激活后可啟動(dòng)凋亡程序而激活Caspase-8、Caspase-3，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示，模型組凋亡指數(shù)及Fas、Cleaved Caspase-3蛋白水平明顯升高，而SNHG7過(guò)表達(dá)后凋亡指數(shù)及Fas、Cleaved Caspase-3蛋白水平明顯降低，提示SNHG7過(guò)表達(dá)可抑制心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡。心肌梗死后炎癥也可參與心肌缺血性損傷，心肌炎癥反應(yīng)在心功能障礙中發(fā)揮重要作用，減輕炎癥反應(yīng)可減輕心肌損傷，其中，炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β可能是心肌缺血后心功能障礙的重要刺激因子，并可能是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的重要影響因素[17]。本研究結(jié)果顯示，心肌梗死后小鼠心肌組織中TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA的表達(dá)水平明顯升高，而SNHG7過(guò)表達(dá)后TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA的表達(dá)水平明顯降低，提示SNHG7過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)從而減輕心肌炎性反應(yīng)。

miR-223屬于髓系特異性miRNA，其在心血管疾病中表達(dá)異常，并可能通過(guò)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的多種基因表達(dá)參與動(dòng)脈粥樣硬化、心肌代謝等多種疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[18]。miR-223在心肌梗死病人血清中的表達(dá)水平明顯升高，并可能作為預(yù)測(cè)心肌梗死的輔助指標(biāo)，同時(shí)通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-223可促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[19]。大黃素通過(guò)下調(diào)miR-223的表達(dá)而減輕脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[20]。與上述研究結(jié)果相似，本研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)缺氧/缺血誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中SNHG7的表達(dá)水平明顯降低，miR-223的表達(dá)水平明顯升高。本研究證實(shí)SNHG7可靶向結(jié)合miR-223，并可負(fù)向調(diào)控miR-223的表達(dá)及活性。提示SNHG7可能通過(guò)下調(diào)miR-223的表達(dá)從而對(duì)心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，SNHG7過(guò)表達(dá)可抑制小鼠心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與靶向調(diào)控miR-223的表達(dá)有關(guān)，SNHG7可能作為心肌梗死等心血管疾病診斷及治療的潛在靶點(diǎn)，但關(guān)于心肌細(xì)胞損傷過(guò)程中SNHG7如何調(diào)控miR-223表達(dá)及其下游靶基因表達(dá)尚不清楚，其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。