胡偉偉 謝一龍 蘇賢德 陸建勝通訊作者）

正大天晴藥業(yè)集團(tuán)南京順欣制藥有限公司 江蘇南京 210000

用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)的生物制品，病毒污染風(fēng)險(xiǎn)是一個(gè)主要的安全問(wèn)題。為了確保產(chǎn)品的安全，監(jiān)管機(jī)構(gòu)需要生產(chǎn)商證明生產(chǎn)產(chǎn)品的工藝有足夠的病毒去除能力，并在生產(chǎn)過(guò)程監(jiān)控納濾載量不超過(guò)病毒驗(yàn)證的載量[1-4]。

除病毒過(guò)濾通過(guò)分子排阻原理實(shí)現(xiàn)去除病毒，作為一種能夠高效去除病毒的方法，廣泛用于治療性蛋白藥物下游純化工藝。由于納濾膜成本高且一次性使用，因此迫切需要通過(guò)獲得最高的過(guò)濾膜載量，降低納濾工藝成本。因此，從安全性、成本以及法規(guī)監(jiān)管的角度出發(fā)，設(shè)計(jì)一個(gè)既能滿足高通量，又能高效的病毒的工藝至關(guān)重要[5]。

在中試室放大生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，T1320150401批次1000L規(guī)模純化時(shí)，納濾過(guò)程中出現(xiàn)通量快速衰減、納濾膜堵塞的現(xiàn)象，導(dǎo)致膜通量急聚下降，為了保持納濾工藝的穩(wěn)定性，通過(guò)納濾小試的分析，確定影響通量的限制性因素。

1 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品

T1320150401批次原液樣品，SEC主峰含量96.5%，濃度25.6g/L。

1.1.2 試劑和耗材

配置緩沖液的試劑均為化學(xué)純，購(gòu)自南京晚晴化玻儀器有限公司；納濾膜Viresolve Pro（面積3.1cm2）、Viresolve Pro Modus1.2（面 積0.07m2）、Viresolve Pro Modus1.3（面 積0.22m2），攔截尺寸為20nm（病毒顆粒大于20nm，蛋白分子為10-15nm），均購(gòu)于Merck Millipore。

1.1.3 儀器

層析系統(tǒng)為?KTA Purifier、?KTA Process購(gòu)自GE公司；UV-1200紫外分光光度計(jì)購(gòu)自上海美普達(dá)，電子天平（精度0.01，量程大于500g）購(gòu)于梅特勒。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同純度樣品的制備

T1320150401批次原液通過(guò)陽(yáng)離子層析精制兩個(gè)純度樣品，樣品一：SEC純度98.0%，聚合物1.92%，編號(hào)為NF-1；樣品二：SEC純度97.5%，聚合物2.43%，編號(hào)為NF-2；樣品三：對(duì)T1320150401批次原液樣品用陽(yáng)離子洗脫液進(jìn)行換液，得到SEC純度為96.0%，聚合物為3.99%，編號(hào)為NF-3。

1.2.2 納濾的原理和步驟

本試驗(yàn)采用Vmax 法，對(duì)料液進(jìn)行試驗(yàn)。Vmax試驗(yàn)即恒壓試驗(yàn)，即在恒定壓力下使料液通過(guò)過(guò)濾器，并在一定時(shí)間間隔記錄濾液體積；是一種加速試驗(yàn)，基本原理是依據(jù)濾膜逐漸堵塞模型方程，可以預(yù)知濾器的最大負(fù)載和流量衰減，從而進(jìn)行過(guò)濾器的選型放大，適用于所有表面過(guò)濾和膜過(guò)濾器。

1.2.2.1 納濾工藝條件

恒壓30psi，樣品濃度10g/L，納濾時(shí)間2小時(shí)（備注：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的溫度和緩沖液均相同）。

1.2.2.2 納濾操作流程

安裝Vmax 系統(tǒng)（壓力罐、壓力表、帶閥門的出口、壓縮空氣入口、除病毒過(guò)濾器，天平或量筒）。

連接壓縮空氣到壓力罐，調(diào)節(jié)壓力至試驗(yàn)壓力并檢查有無(wú)泄漏，然后釋放壓力。

連接所需測(cè)試的過(guò)濾器，需事先潤(rùn)濕膜片，在濾器下游安裝閥門便于上游排氣。

關(guān)閉濾器上、下游閥門，在壓力罐中裝入料液，調(diào)節(jié)壓力至設(shè)定壓力。

打開(kāi)濾器上游閥門，潤(rùn)濕濾器；然后打開(kāi)排氣口閥門充分排出空氣。

在潤(rùn)濕和排氣后，打開(kāi)下游閥門，當(dāng)?shù)谝坏瘟弦哼M(jìn)入收集容器時(shí)開(kāi)始秒表計(jì)時(shí)。

濾液收集在燒杯或其它合適的容器中。

在適當(dāng)時(shí)間間隔測(cè)定濾液體積（通?？梢詼y(cè)定重量進(jìn)行轉(zhuǎn)換），持續(xù)120分鐘。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 樣品聚體含量對(duì)納濾的影響--Scale-down

按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通過(guò)Scale-down方式按照1.2.2的實(shí)驗(yàn)方法完成不同聚體含量對(duì)納濾膜包載量的影響實(shí)驗(yàn)。

2.1.1 樣品聚體含量對(duì)過(guò)濾通量的影響

圖1 樣品過(guò)濾量和過(guò)濾瞬時(shí)通量過(guò)程變化曲線

由圖1可知，在2小時(shí)的過(guò)濾時(shí)間內(nèi)，隨著樣品聚體的增加，納濾的過(guò)濾量明顯降低，其中NF-1的過(guò)濾量是NF-2的1.36倍。由過(guò)濾瞬時(shí)通量曲線可知，隨著樣品聚體的增加，通量衰減的越快，其中NF-1過(guò)濾瞬時(shí)通量曲線緩慢衰減，2小時(shí)后瞬時(shí)通量為起始的84.8%；NF-2過(guò)濾瞬時(shí)通量曲線衰減較快，2小時(shí)后瞬時(shí)通量為起始的40.2%；NF-3過(guò)濾30分鐘后，瞬時(shí)通量衰減至0，共過(guò)濾12.9mL樣品。

2.1.2納濾前后對(duì)樣品聚體含量的影響

圖2 樣品納濾前后聚合物含量的變化

為了進(jìn)一步探究不同聚體含量樣品通量衰減差異的原因，檢測(cè)了納濾前后聚體含量。結(jié)果表明：聚體能夠被截留，并不同程度堵塞納濾膜。由圖2結(jié)果可知，隨著過(guò)濾前樣品的聚體含量越高，過(guò)濾后樣品的聚體降低幅度越大。樣品NF-2和NF-1相比，納濾前后聚體含量有下降趨勢(shì)，說(shuō)明部分聚體被納濾膜截留，導(dǎo)致過(guò)濾樣品的體積減少40mL以及瞬時(shí)通量衰減的更快；樣品NF-3，納濾前后聚體含量下降很明顯，大量聚體被截留，導(dǎo)致納濾膜30分鐘就被完全堵死。

2.1.3 樣品聚體含量對(duì)納濾膜載量的影響

圖3 不同樣品純度的納濾膜載量

納濾膜載量作為納濾膜面積選型的重要依據(jù)，由圖1的結(jié)果計(jì)算出不同聚體含量樣品對(duì)應(yīng)的過(guò)濾膜載量。由圖3可知，隨著樣品聚體含量的增加，納濾膜載量急劇下降。

T1320150401批次1000L規(guī)模的純化，納濾工藝放大時(shí)，樣品的純度為96.5%，過(guò)濾30g的樣品后，瞬時(shí)過(guò)濾通量衰減至0，此時(shí)納濾膜載量為0.43kg/m2，和樣品NF-3實(shí)驗(yàn)的載量和瞬時(shí)過(guò)濾通量衰減趨勢(shì)一致。

目前，中試車間納濾工藝的成本很高，占下游純化總成本30-40%，因此需要建立中控指標(biāo)，確保納濾工藝的順利進(jìn)行?；诩{濾通過(guò)分子大小進(jìn)行孔徑截留，確定聚體含量作為該工藝前的CQA指標(biāo)。結(jié)合納濾小試結(jié)果和上游細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)品質(zhì)量，可以初步內(nèi)控納濾前樣品的聚體含量不超過(guò)2.0%，通過(guò)工藝放大來(lái)進(jìn)行確認(rèn)。

2.2 聚體含量對(duì)納濾膜通量的影響確認(rèn)—Scale-up

圖4 納濾過(guò)程示意圖

按照?qǐng)D4的裝置圖，進(jìn)行T13201512021000L的納濾工藝放大，樣品的過(guò)濾濃度為10g/L，納濾膜面積0.22m2，使用30psi恒定壓力過(guò)濾，記錄過(guò)濾的瞬時(shí)流速并轉(zhuǎn)化為瞬時(shí)通量（LMH），繪制成瞬時(shí)通量隨時(shí)間的變化曲線（圖5）。

由圖5可知，隨著納濾的進(jìn)行，納濾的瞬時(shí)通量逐漸降低，過(guò)濾2小時(shí)，過(guò)濾瞬時(shí)通量降為初始的36.3%；由圖2可知納濾前后樣品的聚合物含量基本維持不變，說(shuō)明納濾膜基本沒(méi)有截留聚合物；同時(shí)，在2小時(shí)內(nèi)過(guò)濾810g蛋白/0.22m2，超過(guò)病毒驗(yàn)證時(shí)的704g蛋白/0.22m2的上限，說(shuō)明納濾工藝放大成功。

圖5 納濾通量隨時(shí)間的變化關(guān)系曲線

2.3 納濾工藝：小試和放大至生產(chǎn)規(guī)模的差異分析

由圖1的NF1和5瞬時(shí)通量曲線可知，小試和放大時(shí)的瞬時(shí)通量并未做到線性放大，主要由于膜包的規(guī)格型號(hào)差異以及設(shè)備系統(tǒng)差異造成；由圖3表明，小試和放大的質(zhì)量載量并非隨著聚體含量的增加線性降低，當(dāng)聚合物含量在3.5%以上時(shí)，容易堵塞納濾膜，導(dǎo)致載量極低，代表了樣品的一種最差條件，在大生產(chǎn)時(shí)應(yīng)建立中控限度來(lái)避免；納濾工藝在放大時(shí)并非單因素的線性放大，與產(chǎn)品的純度、樣品的溫度、粒徑分布、濃度、凍融情況以及放大用膜包和小試膜規(guī)格型號(hào)不一致等因素有關(guān)；根據(jù)供應(yīng)商的建議，在大生產(chǎn)納濾膜面積的確定需要乘以1.2-1.5的安全系數(shù)，來(lái)減少批次間的差異對(duì)膜工藝選擇的干擾，確保納濾工藝的穩(wěn)定進(jìn)行。由小試和放大至生產(chǎn)規(guī)模的差異分析，小試研究聚體含量對(duì)膜通量影響能夠確定樣品的最差條件，同時(shí)能夠確定聚合物含量對(duì)膜載量的變化趨勢(shì)，由于大生產(chǎn)時(shí)納濾工藝的成本高，納濾工藝放大前需要確定中控指標(biāo)，確定過(guò)濾前樣品聚體含量和膜的質(zhì)量載量，為后續(xù)2000L大生產(chǎn)提供納濾膜面積的選型和中控CQA限度。

基于T131000L規(guī)模放大的納濾工藝參數(shù)以及納濾病毒驗(yàn)證的結(jié)果，建議2000L規(guī)模放大的納濾膜面積1.15-1.43m2，納濾前樣品聚體不高于2%。（備注：建議膜面積=膜載量＊安全系數(shù)；2000L規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)工作體積1700L，表達(dá)量2.0g/L，當(dāng)工藝放大膜載量大于VC載量時(shí)，以VC載量作為膜面積選型的載量）

3 結(jié)語(yǔ)

樣品的聚體含量對(duì)納濾通量有著重要的影響，當(dāng)樣品聚體大于3.5%時(shí)，過(guò)濾樣品時(shí)很容易堵塞納濾膜，膜載量很低；當(dāng)樣品聚體小于2%時(shí)，過(guò)濾前后樣品聚體含量基本不變，聚體不會(huì)被納濾膜截留，此時(shí)聚體含量對(duì)納濾工藝的影響會(huì)降低，分別進(jìn)行了兩批1000L工藝的放大驗(yàn)證了小試的結(jié)論。

SEC純度對(duì)納濾工藝的影響并非線性的，本文的研究?jī)?nèi)容針對(duì)抗體藥物可能具有通用性，后續(xù)研究會(huì)繼續(xù)關(guān)注?；诩{濾小試和放大的差異，建議每個(gè)項(xiàng)目做一次生產(chǎn)規(guī)模的工藝放大；為了保證納濾工藝的穩(wěn)定放大，需要建立關(guān)鍵的中控參數(shù)，比如樣品SEC純度、粒徑分布等。