董雪琪，高 燕

骨骼肌是人的運(yùn)動(dòng)器官，負(fù)責(zé)運(yùn)動(dòng)和體熱的產(chǎn)生。近年研究證實(shí)，骨骼肌具有內(nèi)分泌功能并能合成、分泌多種肌肉因子，通過自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌的方式參與機(jī)體葡萄糖和脂肪酸代謝[1-3]。多種肌肉因子被認(rèn)為是預(yù)防2型糖尿病等慢性代謝性疾病的重要因素[4-5]。musclin作為骨骼肌細(xì)胞特異性分泌的多肽蛋白質(zhì)，受營(yíng)養(yǎng)條件和激素尤其是胰島素的調(diào)控參與細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用，與胰島素抵抗、2型糖尿病的發(fā)生存在一定關(guān)系[6-7]。myonectin又稱補(bǔ)體C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白15，是骨骼肌分泌的一種新型生物活性物質(zhì)[8]，其表達(dá)量與血脂、血糖水平顯著相關(guān)[9]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用高糖高脂、2型糖尿病大鼠模型，觀察高糖高脂下musclin、myonectin mRNA的表達(dá)及阿托伐他汀鈣干預(yù)對(duì)其表達(dá)的影響，以探討阿托伐他汀鈣對(duì)骨骼肌糖代謝影響的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠50只，8周齡，體質(zhì)量180～220 g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(魯)20140007,動(dòng)物合格證號(hào)：37009200014560。于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飲食、進(jìn)水自由。動(dòng)物飼料購(gòu)于北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司。

1.2造模、分組及給藥 將50只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(n=10)、高糖高脂組(n=20)、糖尿病組(n=20)?？瞻讓?duì)照組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，高糖高脂組及糖尿病組大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)。4周后，糖尿病組大鼠予鏈脲佐菌素(STZ)40 mg/kg腹腔注射，余2組注射等體積枸櫞酸鹽緩沖液。注射1周后監(jiān)測(cè)糖尿病組大鼠空腹血糖(FPG)，F(xiàn)PG≥11.1 mmol/L即造模成功。造模成功后，將高糖高脂組及糖尿病組大鼠分別隨機(jī)分為高糖高脂模型組、高糖高脂治療組、糖尿病模型組、糖尿病治療組，每組各10只大鼠。高糖高脂治療組、糖尿病治療組在高糖高脂飼料喂養(yǎng)的同時(shí)，給予阿托伐他汀鈣8.4 mg/kg灌胃，余3組使用同等劑量0.9%氯化鈉注射液灌胃，共6周。

1.3骨骼肌標(biāo)本的采集和處理 6周干預(yù)后，所有大鼠禁食、水12 h,于次日分批腹腔注射10%的水合氯醛溶液麻醉，麻醉成功后分離后肢骨骼肌組織，取部分骨骼肌組織迅速放入液氮罐中冷凍，取材完畢統(tǒng)一轉(zhuǎn)移置-70℃冰箱中保存，用于反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)。另留取部分骨骼肌組織置于10%福爾馬林液中固定，用于HE染色顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察。

1.4myonectin、musclin mRNA實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè) 取適量骨骼肌組織樣本加入Trizol 1 ml充分裂解后加入三氯甲烷200 μl，混勻、離心后收集上清，轉(zhuǎn)移至新1.5 ml EP管中；加入等體積的異丙醇，充分混勻后離心，棄上清；加入75%乙醇，充分混勻離心；倒掉酒精，晾干，加入DEPC 40 μl水溶解RNA。使用超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA純度，A260/A280比值為1.8～2.0。采用Aidlab公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，-80℃保存。以β-actin為內(nèi)參基因行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，反應(yīng)條件：95℃ 3 min、95℃ 10 s、60℃ 30 s，共39個(gè)循環(huán)。引物信息見表1。以β-actin為內(nèi)參，利用2-ΔΔCt計(jì)算各樣品基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物信息

2 結(jié)果

2.1各組大鼠光鏡下骨骼肌組織形態(tài)學(xué)比較 空白對(duì)照組大鼠光鏡下骨骼肌肌纖維大小一致，粗細(xì)均勻，未見細(xì)胞核內(nèi)移。模型組、治療組大鼠骨骼肌組織較空白對(duì)照組大鼠均出現(xiàn)退行性改變。與空白對(duì)照組大鼠相比，高糖高脂模型組及糖尿病模型組大鼠骨骼肌肌纖維大小不一，有核內(nèi)移，肌纖維分裂。與模型組大鼠相比，高糖高脂治療組及糖尿病治療組大鼠骨骼肌雖有肌纖維大小不一、核內(nèi)移、肌纖維分裂等變化，但損傷較小，核內(nèi)移比例較低，肌纖維粗細(xì)相對(duì)一致。見圖1。

圖1 5組大鼠光鏡下骨骼肌組織形態(tài)學(xué)比較(HE×200)

2.2各組大鼠骨骼肌musclin、myonectin mRNA表達(dá)水平比較 與空白對(duì)照組大鼠相比，高糖高脂模型組和糖尿病模型組大鼠骨骼肌musclin、myonectin mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)；高糖高脂治療組與高糖高脂模型組大鼠相比musclin、myonectin mRNA表達(dá)水平明顯降低，但與空白對(duì)照組大鼠比較表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；糖尿病治療組與糖尿病模型組大鼠比較，musclin、myonectin mRNA表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與空白對(duì)照組大鼠比較表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠骨骼肌中musclin myonectin mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

隨著飲食結(jié)構(gòu)的變化，人們?nèi)粘z入糖類、脂類物質(zhì)比例增加，2型糖尿病的患病率逐年上升，成為繼腫瘤和心血管疾病后第三大威脅健康的慢性疾病[10-11]。糖尿病發(fā)病的主要機(jī)制為胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能損傷，分子水平方面主要與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體及胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)[12-13]。胰島素抵抗主要發(fā)生在骨骼肌、肝臟和脂肪組織中[14]。骨骼肌作為人體重要的內(nèi)分泌器官可分泌多種生物活性因子，在預(yù)防肥胖、胰島素抵抗和相關(guān)疾病(包括2型糖尿病)中起重要作用[15]。

musclin作為肌源性分泌因子與肌肉組織的葡萄糖攝取、脂肪酸代謝、胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)緊密關(guān)聯(lián)[16-17]。研究證實(shí)，在胰島素誘導(dǎo)分化的C2C12細(xì)胞中musclin表達(dá)顯著上調(diào)[7]。PI3K/AKT途徑是促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4(GLUT-4)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)重要的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路[18]。musclin能夠下調(diào)胰島素誘導(dǎo)大鼠分化的成肌細(xì)胞模型中PI3K和AKT/PKB mRNA的表達(dá)，減弱GLUT-4活性，從而抑制葡萄糖攝取及糖原合成[19]。AKT/FOXO1信號(hào)傳導(dǎo)通路處于胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路下游，是調(diào)節(jié)糖原合成并維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)的重要途徑，能夠有效改善胰島素抵抗[20]。而FOXO1作為PI3K途徑的下游因子，可下調(diào)musclin mRNA的表達(dá)[20]。本研究顯示，與空白對(duì)照組大鼠相比，糖尿病模型組、高糖高脂模型組大鼠骨骼肌musclin mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，進(jìn)一步證明musclin可以降低PI3K、AKT/PKB mRNA的表達(dá)，抑制GLUT-4活性及細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取。而阿托伐他汀鈣則能顯著降低高糖高脂治療組大鼠骨骼肌中musclin mRNA的表達(dá)，但對(duì)糖尿病治療組無顯著影響，提示阿托伐他汀鈣對(duì)糖尿病早期的調(diào)節(jié)作用可能是通過抑制musclin的表達(dá)以調(diào)控胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路，來維持葡萄糖和脂肪酸在營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下的代謝平衡。

myonectin作為一種在骨骼肌中特異性表達(dá)的肌源性分泌因子，介導(dǎo)骨骼肌與肝臟、脂肪等器官或組織之間的“對(duì)話”，其表達(dá)水平受機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀況影響[21]。Seldin等[8]對(duì)隔夜禁食小鼠分別用葡萄糖和脂肪乳劑進(jìn)行灌胃，結(jié)果證明二者均能誘導(dǎo)myonectin水平升高。在跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)高脂飲食大鼠myonectin表達(dá)影響的研究中同樣證實(shí)，高脂飼養(yǎng)可顯著升高骨骼肌中myonectin mRNA的表達(dá)水平，而運(yùn)動(dòng)則明顯降低肥胖大鼠骨骼肌中myonectin mRNA的表達(dá)水平[9]，提示機(jī)體血糖、血脂的升高可促進(jìn)骨骼肌中myonectin mRNA的表達(dá)。相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)，新發(fā)2型糖尿病患者血漿myonectin水平較正常人顯著升高，且血漿myonectin水平與胰島素抵抗程度呈正相關(guān)[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高糖高脂狀態(tài)引發(fā)myonectin mRNA表達(dá)大幅上升，因此可以推斷myonectin可能作為一種代謝感應(yīng)因子參與胰島素抵抗，在高糖高脂狀態(tài)下代償性增高。但阿托伐他汀鈣可明顯下調(diào)高糖高脂治療組myonectin mRNA的表達(dá)，而對(duì)糖尿病治療組myonectin mRNA的表達(dá)無明顯影響，說明阿托伐他汀鈣能改善糖尿病前期糖脂代謝，這可能是通過對(duì)myonectin水平的調(diào)控影響胰島素抵抗來實(shí)現(xiàn)的。

綜上，糖尿病早期阿托伐他汀鈣可經(jīng)下調(diào)musclin、myonectin mRNA表達(dá)進(jìn)一步調(diào)控PI3K/AKT通路，改善胰島素抵抗，調(diào)節(jié)糖代謝水平。提示臨床應(yīng)盡早使用阿托伐他汀鈣對(duì)糖尿病患者進(jìn)行干預(yù)。