張姍姍 趙 凡 魏小豹 張秀新 曾秀麗

(西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院蔬菜研究所1，拉薩 850032) (寧波大學(xué)海洋學(xué)院2，寧波 315211) (中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所3，北京 100081)

伴隨經(jīng)濟發(fā)展和人民生活水平的提高，綠色健康具有保健功能的食品越來越受到人們推崇。2011年中國衛(wèi)生部發(fā)布了《關(guān)于批準(zhǔn)元寶楓籽油和牡丹籽油作為新資源食品的公告》，牡丹籽油因富含亞油酸和亞麻酸[1]，迅速受到關(guān)注。亞油酸和亞麻酸是人體所必需但不能自身合成的營養(yǎng)元素[2，3]，亞油酸有助于降低血清膽固醇水平、抑制動脈血栓的形成、降低血壓、抑制癌癥發(fā)生、預(yù)防老年癡呆[4-6]，亞麻酸也被稱為“腦黃金原料”，在人體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為EPA和DHA[7]，具有提高嬰幼兒智力、保護視力、提高免疫力的作用[8-10]。植物油脂中脂質(zhì)主要是甘油三酯，但甘油三酯的沸點比較高，不容易氣化及分離，并且甘油三酯的類型太多，不容易辨別，甲酯化之后每種脂肪酸甲酯都成為單獨的組分，再利用GC-MS可以較為容易且準(zhǔn)確地測定每種脂肪酸甲酯的種類和含量。

牡丹具有分布范圍廣、耐貧瘠、耐粗放管理、壽命長等特點[11，12]，因此油用牡丹種植在全國迅速發(fā)展起來?，F(xiàn)階段作為油用牡丹開發(fā)的牡丹品種主要是‘鳳丹’和栽培紫斑牡丹[12]。這兩類品種分別屬于江南牡丹品種群和西北牡丹品種群[11,13]，兩者原產(chǎn)地氣候類型迥異，但因兩類牡丹結(jié)實能力較強[12]，在全國多地都有引種栽培。研究表明，相同作物的不同品種類型對環(huán)境的適應(yīng)能力會有明顯差異[14，15]，同時環(huán)境因素對于作物的品質(zhì)和產(chǎn)量都會產(chǎn)生較為明顯的影響[16-18]，油用牡丹產(chǎn)業(yè)雖然發(fā)展勢頭迅猛，但關(guān)于其基礎(chǔ)性研究相對薄弱，研究主要集中在牡丹籽油的脂肪酸組分及加工提取工藝上[19-21]，對不同品種、不同地區(qū)牡丹的產(chǎn)量、油脂品質(zhì)等油用牡丹的整體資源狀況的了解還基本處于空白階段，因此有必要對不同產(chǎn)地及不同品種的油用牡丹的油脂品質(zhì)進行評價，為油用牡丹產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供參考。本研究通過對不同產(chǎn)地‘鳳丹’和紫斑牡丹種子脂肪酸組分的比較，探究兩類主要油用牡丹品種籽油脂肪酸的特點和差異，并分析了脂肪酸組分與環(huán)境因子的關(guān)系，以期為不同地區(qū)油用牡丹品種的選擇提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2015年8—9月選取環(huán)境差異較大的油用牡丹產(chǎn)地河南洛陽、湖北?？?、陜西西安、甘肅蘭州、北京和西藏拉薩采收油用牡丹種子。每個產(chǎn)地選取同一塊樣地中果實發(fā)育正常的‘鳳丹’和紫斑牡丹成熟果莢，每個品種分布選取至少10個不同單株的果莢，2個品種分別用網(wǎng)袋封裝，掛號標(biāo)簽，放置與實驗室內(nèi)自然風(fēng)干，待果莢自然開裂后取出種子。采收果莢的同時使用手持GPS測定采樣點的經(jīng)緯度和海拔，年降雨量和年平均氣溫數(shù)據(jù)來源于中國氣象局國家氣象信息中心(http://cdc.cma.gov.cn)，各樣地環(huán)境生態(tài)因子見表1。

表1 油用牡丹樣地的生態(tài)環(huán)境因子

1.2 種子百粒質(zhì)量測定

將自然風(fēng)干的種子置于45 ℃烘箱中烘干48 h，后稱取每份樣品的百粒質(zhì)量。百粒質(zhì)量的測定方法為：首先將每份樣品中的干癟種子去除，后隨機從中選取100粒種子稱取質(zhì)量，每份樣品重復(fù)進行3次百粒質(zhì)量測定。

1.3 脂肪酸成分分析

取干燥后的種子去掉種皮，種仁用冷凍研磨機進行粉碎用于后續(xù)實驗。脂肪酸成分的提取和檢測參考曾秀麗等[23]的方法。準(zhǔn)確稱取約0.50 g樣品粉末于 10 mL玻璃試管中，后加入 3.0 mL 氯仿:甲醇溶液(體積比為1∶2)，充滿氮氣后漩渦振蕩混勻；4 ℃靜置過夜，后補充1.0 mL的氯仿；混勻后再加入 1.8 mL 的1 mol/L KCl 溶液，充分振蕩后2 500 r/min 離心10 min，吸取下層氯仿相 1.0 mL；用氮氣吹干氯仿后加入1.0 mL 硫酸甲醇溶液(5%硫酸+95%甲醇)，充氮氣后密封；將試管在90 ℃水浴 1 h；冷卻至室溫后加入1.5 mL 正戊烷和 1.0 mL水終止甲基化反應(yīng)；振蕩后2 500 r/min 離心10 min，收集上清液；氮氣吹干后加入 5.0 mL 重蒸的正己烷，取1.0 mL 提取液，用0.22 μm 尼龍微孔濾器過濾到樣品瓶中，每個樣品中加入10 μL內(nèi)標(biāo)(4 mg/mL十七烷酸甲酯正己烷溶液)。

所用分析系統(tǒng)為GC/MS-QP5050A 氣質(zhì)聯(lián)用儀，色譜柱為 Supelco SP-2560 (100 m×0.25 mm×0.20 μm)。分析脂肪酸所用的升溫程序如下：100 ℃保持5 min，然后以4 ℃/min升溫至240 ℃，保持15 min；載氣：氦氣，純度≥99.999%，流速為1 mL/min；進樣口溫度程序：250 ℃，進樣方式：不分流，進樣量1 μL；溶劑切除時間12.5 min，檢測器電壓：0.1 kV；GC-MS接口溫度：250 ℃。采用 NIST05 Library 標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索和與標(biāo)準(zhǔn)品比對定性。

1.4 脂肪酸的定量分析

牡丹種子油中5個主要成分為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和α-亞麻酸，利用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進行定量分析，以牡丹種子油中不存在的十七烷酸作為內(nèi)標(biāo)。配制不同質(zhì)量濃度的5個標(biāo)準(zhǔn)品，包括 0.015 625～1.0 mg/mL等7個濃度，制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式見表2。樣品中其他微量成分僅用內(nèi)標(biāo)相對定量。

表2 牡丹種子中5種主要脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

利用SPSS 19.0和Excel 2010對數(shù)據(jù)進行方差分析、差異顯著性分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要脂肪酸的定性分析

利用建立的GC-MS方法對不同產(chǎn)地的牡丹籽油脂肪酸成分進行定性分析(圖1)，比較脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的色譜峰保留時間，根據(jù)相關(guān)色譜的離子質(zhì)量，確定主要脂肪酸的種類(表3)，同時也檢測到部分微量脂肪酸：十五烷酸(C15H30O2，32.532 min)、棕櫚一烯酸(C16H30O2，35.591 min)、十七烷一烯酸(C17H32O2，37.155 min)、花生酸(C20H40O2，40.579 min)、γ-亞麻酸(C18H30O2，41.381 min)和二十一烷酸(C21H42O2，41.998 min)。

注：PA：棕櫚酸，IS：內(nèi)標(biāo)(十七烷酸)，SA：硬脂酸，OA：油酸，LA：亞油酸，ALA：α-亞麻酸。圖1 樣品脂肪酸甲酯的總離子流圖

表3 樣品種子中脂肪酸組分的GC-MS分析

2.2 不同產(chǎn)地兩種牡丹種子百粒質(zhì)量研究

對6個產(chǎn)地的‘鳳丹’和紫斑牡丹種子百粒質(zhì)量統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)(表4)，不同樣品百粒質(zhì)量存在顯著性差異。所有樣品種，洛陽產(chǎn)‘鳳丹’種子的百粒質(zhì)量最大，平均(32.69±0.44) g，蘭州產(chǎn)‘鳳丹’種子的百粒質(zhì)量最小，平均為(19.56±0.33) g，比最高百粒質(zhì)量減少了約40%。不同產(chǎn)地‘鳳丹’種子百粒質(zhì)量平均在(9.56～32.69) g之間，平均為25.21 g，樣品之間差異顯著；不同產(chǎn)地紫斑牡丹種子百粒質(zhì)量平均在(24.32～25.39) g之間，不同產(chǎn)地之間種子質(zhì)量變化較小，差異不顯著。

表4 不同產(chǎn)地‘鳳丹’和紫斑牡丹種子百粒質(zhì)量、脂肪酸含量/mg/g(D.W.)

分析牡丹百粒質(zhì)量與環(huán)境因子的相關(guān)性(表5)發(fā)現(xiàn)，百粒質(zhì)量與緯度呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，與海拔表現(xiàn)顯著負相關(guān)，即海拔越高，種子百粒質(zhì)量越小。

表5 牡丹種子百粒質(zhì)量及脂肪酸組分與環(huán)境生態(tài)因子相關(guān)性

2.3 不同產(chǎn)地兩種牡丹種子脂肪酸組分研究

本研究通過GC-MC檢測到‘鳳丹’和紫斑牡丹籽油脂肪酸主要成分5種：α-亞麻酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸和亞麻酸(表4)，與前人關(guān)于油用牡丹籽油成分的研究結(jié)果一致[17-20]。油用牡丹籽油各組分含量的結(jié)果顯示，‘鳳丹’和紫斑牡丹籽油均富含不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的85%以上，其中α-亞麻酸含量最高，平均為(57.25±8.11) mg/g，與前人的研究結(jié)果一致[15,17，18]，但不同樣本之間存在差異，其中保康紫斑牡丹籽油α-亞麻酸含量最高(75.61±7.70) mg/g，蘭州紫斑牡丹含量最低(43.57±2.70) mg/g；不同種及不同產(chǎn)地油用牡丹籽油中油酸和亞油酸含量存在差異，12份樣品的油酸含量平均值(28.84±7.80) mg/g高于亞油酸含量(25.82±7.75) mg/g。洛陽和蘭州產(chǎn)‘鳳丹’亞油酸含量高于油酸含量，其他樣品都表現(xiàn)為油酸含量高于亞油酸含量。韓雪源等[17]分析了7個不同產(chǎn)地的‘鳳丹’籽油脂肪酸含量，7個產(chǎn)地的牡丹籽油中亞油酸含量均高于油酸含量；該研究所用樣品僅有洛陽產(chǎn)地與本研究相同，同時本研究的洛陽產(chǎn)‘鳳丹’確實表現(xiàn)出亞油酸含量高于油酸含量。李莉莉等[23]對蘭州產(chǎn)紫斑牡丹籽油脂肪酸組分分析發(fā)現(xiàn)，紫斑牡丹籽油的油酸含量高于亞油酸含量，Li等[15]利用GC-MS分析了60個栽培牡丹及2個野生牡丹(楊山牡丹和紫斑牡丹)籽油脂肪酸組分，也發(fā)現(xiàn)部分品種表現(xiàn)為油酸含量高于亞油酸含量，兩個野生種中，楊山牡丹亞油酸含量高于油酸含量，而紫斑牡丹相反。‘鳳丹’和紫斑牡丹這兩類油用牡丹品種其主要形成親本不同，研究根據(jù)形態(tài)及分子生物學(xué)證據(jù)，認為‘鳳丹’是由野生種楊山牡丹(P.ostii)獨立馴化選育出的品種[24，25]；栽培紫斑牡丹是由分布于西北地區(qū)的野生紫斑牡丹(P.rockii)與中原等地的栽培牡丹(P.suffruticosa)經(jīng)過反復(fù)雜交形成的品種群，即西北牡丹品種群(紫斑牡丹品種群)[11,24,26]?！P丹’長期以來作為重要的中藥‘丹皮’的主要來源，同時也是牡丹嫁接使用的重要砧木，在各個牡丹產(chǎn)區(qū)都廣泛種植，通過自然授粉獲得種子生產(chǎn)種苗[12]，因此在長期的馴化栽培過程中必然會與產(chǎn)地的其他種質(zhì)資源產(chǎn)生基因交流，導(dǎo)致變異的產(chǎn)生，因此不同產(chǎn)地‘鳳丹’油酸和亞油酸含量存在明顯不同也是合理的。飽和脂肪酸在牡丹籽油中含量較少，主要包含棕櫚酸和硬脂酸。

對同一種類牡丹籽油在不同產(chǎn)地的比較發(fā)現(xiàn)(表3)，‘鳳丹’籽油α-亞麻酸含量和總不飽和脂肪酸含量在不同產(chǎn)地之間含量相對穩(wěn)定，不存在顯著差異；總脂肪酸含量除洛陽外，其他5地也不存在顯著差異；油酸含量蘭州和拉薩含量較低，與其他4個產(chǎn)地差異顯著；亞油酸含量洛陽明顯高于其他產(chǎn)地，與其他5個產(chǎn)地形成顯著差異，而其他5個產(chǎn)地之間差異不顯著。紫斑牡丹籽油α-亞麻酸含量、總不飽和脂肪酸含量和總脂肪酸含量在不同產(chǎn)地之間存在差異，其中西安、蘭州和拉薩三地之間差異不顯著，與其他三地的差異顯著；油酸與亞油酸含量的比較發(fā)現(xiàn)：洛陽、保康和北京之間無顯著差異，西安、蘭州和拉薩不存在顯著差異，但前3個產(chǎn)地與后3個產(chǎn)地之間存在顯著差異。本研究的6份紫斑牡丹材料來自紫斑牡丹2個亞種，即太白山紫斑牡丹(P.rockiisubsp.atava)和全緣葉紫斑牡丹(P.rockiisubsp,rockii)[27]的雜交后代，保康紫斑牡丹屬于全緣葉紫斑牡丹的雜交后代，其他地區(qū)的屬于太白山紫斑牡丹雜交后代。不同的種源可能是導(dǎo)致脂肪酸成分差異的重要原因。

對相同產(chǎn)地的不同種類牡丹籽油成分含量分析發(fā)現(xiàn)，總脂肪酸含量、總不飽和脂肪酸含量、α-亞麻酸含量、亞油酸含量、硬脂酸含量和棕櫚酸含量除保康和北京兩產(chǎn)地是紫斑牡丹高于‘鳳丹’外，其他產(chǎn)地均表現(xiàn)為‘鳳丹’高于紫斑牡丹，除洛陽兩份樣品亞油酸含量和硬脂酸含量存在顯著差異外其他指標(biāo)同一產(chǎn)地兩類牡丹之間不存在顯著差異。油酸含量洛陽、保康和北京表現(xiàn)為紫斑牡丹高于‘鳳丹’，其他3個產(chǎn)地為‘鳳丹’高于紫斑牡丹，除西安外，其他5個產(chǎn)地各脂肪酸組分之間不存在顯著差異。相同品種在不同的產(chǎn)地種子質(zhì)量及脂肪酸含量存在明顯的差異，這與前人的研究結(jié)果一致[17]。幾個產(chǎn)地中洛陽的海拔最低，開花最早(4月中旬開花)，蘭州和拉薩的海拔最高，開花最晚(約在5月中下旬開花)，而高海拔地區(qū)夏季較短，氣溫下降較早，導(dǎo)致牡丹種子成熟時間在不同產(chǎn)地之間較為接近，這也導(dǎo)致了高海拔地區(qū)的油用牡丹種子生長發(fā)育時間較低海拔地區(qū)減少了約一個月。Li等[28]通過分析牡丹種子不同發(fā)育時期的脂肪酸組分變化發(fā)現(xiàn)在種子發(fā)育的前90 d中，各脂肪酸組分含量都在不斷增加，本研究中蘭州和拉薩所產(chǎn)牡丹籽油脂肪不飽和脂肪酸及飽和脂肪酸含量均較其他產(chǎn)地的減少，最多減少了約47%，這可能與種子發(fā)育時間較短有關(guān)。紫斑牡丹生育期明顯較‘鳳丹’短，種子成熟期較‘鳳丹’早約15 d，甚至更長，這也進一步導(dǎo)致其脂肪酸含量偏低。

對牡丹籽油脂肪酸組分與環(huán)境因子相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)(表5)：脂肪酸組分含量與緯度、年降雨量和年平均氣溫表現(xiàn)為顯著正相關(guān)(P<0.05)，與海拔表現(xiàn)為顯著負相關(guān)(P<0.05)(表5)，而經(jīng)度對脂肪酸組分含量影響不大，兩者相關(guān)性不顯著。環(huán)境因子對牡丹的生長發(fā)育是相互影響且相互制約的，多重環(huán)境因子的共同作用最終導(dǎo)致不同產(chǎn)地的牡丹年生育期產(chǎn)生了明顯差異，最終也導(dǎo)致了其種子產(chǎn)量及脂肪酸含量的不同，在牡丹年生育期較短地區(qū)牡丹種子質(zhì)量及脂肪酸含量都會有明顯下降。

3 結(jié)論

6個不同產(chǎn)地的‘鳳丹’和紫斑牡丹主要成分為α-亞麻酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸和亞麻酸，其中α-亞麻酸含量在所有樣品中均最高。不同產(chǎn)地不同樣品的五種主要脂肪酸含量存在顯著差異，其中洛陽和蘭州產(chǎn)鳳丹種子的亞油酸含量高于油酸含量，而其他產(chǎn)地的鳳丹亞油酸含量低于油酸含量，此外六個居群中亞油酸含量均低于油酸含量。6個產(chǎn)區(qū)‘鳳丹’種子的脂肪酸含量在104.01～162.21 mg/g之間變化，海拔越高，脂肪酸含量越低，六個產(chǎn)區(qū)紫斑牡丹種子脂肪酸含量在85.87～172.73 mg/g之間變化。其中保康產(chǎn)紫斑牡丹籽油α-亞麻酸含量、不飽和脂肪酸含量及總脂肪酸含量都是最高的。對6個產(chǎn)地兩類油用牡丹比較后發(fā)現(xiàn)，相同產(chǎn)地的‘鳳丹’種子在百粒質(zhì)量、總脂肪含量、不飽和脂肪酸含量等地方普遍高于紫斑牡丹?，F(xiàn)階段主流油用牡丹栽培品種在高海拔地區(qū)均表現(xiàn)為種子質(zhì)量、亞麻酸、總不飽和脂肪酸、總脂肪酸含量降低，這主要與高海拔地區(qū)牡丹種子生長發(fā)育周期縮短有關(guān)，因此現(xiàn)階段推廣的油用牡丹品種在高海拔地區(qū)推廣需謹(jǐn)慎考慮，不可盲目大規(guī)模發(fā)展油用牡丹。