楊新童 閆 蒼 李書國

(河北科技大學，石家莊 050018)

近年來，隨著人們對全谷物功能性活性物質(zhì)研究的進展，發(fā)現(xiàn)其中一些功能性與酚類化合物密切相關(guān)。美國食品藥品管理局(FDA)將全谷食品定義為所含全谷物質(zhì)量比超過51%的食品。流行病學調(diào)查和科學實驗均表明，全谷食品能有效地預防心血管疾病和直腸癌、乳腺癌等某些癌癥，并對肥胖、糖尿病等多種慢性疾病具有預防作用。其中，以烷基間苯二酚最具有代表性[1]。烷基間苯二酚是首次在小麥、黑麥等麥類中發(fā)現(xiàn)的一類特殊的酚類類脂。主要存在于谷物中，其中小麥、黑麥中含量較多，干燥麥粒中其含量大約為0.015%～0.3%，但大麥中含量相對較少[2,3]。研究發(fā)現(xiàn)，谷物中烷基間苯二酚具有抑菌[4,5]、抑制腫瘤[6-8]、抗氧化[9-11]及抑制多種酶活性[12-14]等多種生理功能。此外，烷基間苯二酚可作為全谷物食品的生物標志物。通過檢測人體尿液或血漿中的烷基間苯二酚及其代謝物，可以有效預測全谷物食品的攝入情況[15-17]。同時也可以判斷全谷物制品品質(zhì)(如：全麥粉)，為廣大消費者提供食品質(zhì)量保障。因此，烷基間苯二酚在食品加工中的應(yīng)用、相關(guān)保健食品的研發(fā)以及生理、藥理方面作用極具開發(fā)潛質(zhì)。由此可見，開發(fā)一種快速分析方法對全谷物制品企業(yè)及醫(yī)學研究等極為重要。

目前，國內(nèi)外常用于分析檢測烷基間苯二酚的方法主要有薄層色譜分析法(TLC)、比色法[18]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[19]、紫外分光光度法[20]。以上幾種方法所需操作時間較長，成本較高，而電化學分析方法可以大大縮短檢測時間，其所用試劑較少，節(jié)約成本，且該方法操作簡捷，靈敏度相對較高，可以實現(xiàn)快速高效得出檢測結(jié)果，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用潛力。

本實驗基于烷基間苯二酚在玻碳電極上的氧化還原特征，從而建立一種快速有效檢測烷基間苯二酚的電化學分析方法，并有效應(yīng)用于食品、醫(yī)學等領(lǐng)域中。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

5-十七烷基間苯二酚標準品(純度98%以上，CAS：41442-57-3，分子量：348.562 5)；甲醇、無水乙醇；固藍RR鹽；碳酸鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸(所用試劑均為分析純)； 紫小麥。

1.2 儀器與設(shè)備

LK98BⅡ型微機電化學分析系統(tǒng)，三電極系統(tǒng)(工作電極為玻碳電極，對電極為鉑絲電極，參比電極為Ag/AgCl電極)，KQ 2200型超聲波清洗儀，GZX-9070 MBE型電熱鼓風干燥箱，TGL-10B高速臺式離心機，UV-5500PC紫外可見分光光度計。

1.3 實驗方法

1.3.1 電極預處理

玻碳電極在使用前用0.05 μm的Al2O3粉拋光至鏡面，用去離子水清洗后，再分別用HNO3∶H2O=1∶1、乙醇、去離子水分別進行超聲處理1 min，然后利用快速循環(huán)伏安法在1 mol/L H2SO4溶液中掃描(電位：-0.5～0.8 V 掃描速率：50 mV/s)至穩(wěn)定，對玻碳電極進行活化，用N2吹干后備用。

1.3.2 電解質(zhì)及標準溶液的配制

配制1/15 mol/L Na2HPO4溶液和1/15 mol/L KH2PO4溶液，并根據(jù)2種溶液配比調(diào)節(jié)pH值至9，得到電解質(zhì)溶液；將5 mg烷基間苯二酚標準品以甲醇作溶劑定容于50 mL容量瓶中，得到2.87×10-4mol/L標準溶液，在0～4 ℃避光密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 檢測樣品的處理

取10 g粉碎后的紫小麥，以料液比1∶5的甲醇在100 W功率下超聲20 min，3 000 r/min條件下離心20 min，取上清液并抽濾得到清澈提取液，在0～4 ℃避光密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 電化學方法測定

利用快速循環(huán)伏安法在0.0～1.0 V之間以50 mV/s速度掃描，研究其電化學特征；利用微分脈沖伏安法優(yōu)化檢測條件并考察峰電流值與烷基間苯二酚濃度之間的關(guān)系，其電參數(shù)：初始電位0.0 V，終止電位1.0 V，脈沖間隔0.3 s，電位增量0.008 V。電解質(zhì)溶液：1/15 mol/L Na2HPO4溶液和1/15 mol/L KH2PO4溶液(pH值為9)。

1.3.5 標準曲線及樣品測定

將1.3.2配制的標準溶液分別配制濃度為0、2.5、5、10、15、20、50 μmol/L(與電解質(zhì)溶液混合后濃度)，并根據(jù)上述微分脈沖伏安法分別測定，記錄其電化學響應(yīng)電流值，每個濃度做3組平行實驗，取其平均值作為測定結(jié)果，繪制標準曲線。以上述微分脈沖伏安法測定1.3.3樣品，并根據(jù)標準曲線計算樣品中烷基間苯二酚的含量。

1.3.6 紫外分光光度法測定[20]

固藍RR鹽儲備液的配制：以1%的乙酸的甲醇溶液為溶劑，準確配制質(zhì)量分數(shù)為0.05%的固藍RR鹽儲備液(4 ℃可以保存7 d)。

工作液的配制：將儲備液與甲醇按比例1∶4(體積比)混合，制成固藍RR鹽工作液(現(xiàn)用現(xiàn)配)。

將1.3.2配制的標準溶液分別用甲醇配制濃度為5.738、2.869、1.435、0.717、0.359 μmol/L。取2 mL稀釋后的標準溶液與4 mL固藍RR鹽工作液混合，并用質(zhì)量分數(shù)為5%的K2CO3溶液將溶液調(diào)至堿性，在波長為480 nm處測定吸光度，以甲醇為空白對照。重復3次實驗取平均值，繪制標準曲線。以該紫外分光光度法測定樣品中的烷基間苯二酚，并根據(jù)標準曲線計算1.3.3樣品中烷基間苯二酚的含量。

根據(jù)紫外分光光光度法得到標準曲線：

y=0.051 52x-0.000 125R2=0.996 45

式中：y為吸光度值；x為對應(yīng)烷基間苯二酚濃度/μmol/L。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本實驗數(shù)據(jù)均取3組平行實驗測定值的平均值作為測定結(jié)果，運用SPSS17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，應(yīng)用單因素方差分析進行顯著性差異分析(P<0.05，差異顯著)，并運用Origin8.6繪制數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 烷基間苯二酚在玻碳電極上的電化學行為

循環(huán)伏安圖顯示了烷基間苯二酚在玻碳電極上的電化學行為。如圖1所示，玻碳電極在空白溶液中無峰出現(xiàn)，表明該電極自身和空白底液中不存在具有電化學活性的物質(zhì)。在圖1中0.52 V處有一個顯著的氧化峰，反向掃描無還原峰出現(xiàn)，說明烷基間苯二酚在玻碳電極表面被氧化，發(fā)生明顯的電催化作用，且反應(yīng)不可逆。這是由于芳香環(huán)上的羥基易被氧化，從而使其具有電化學活性，反應(yīng)不可逆可能是由于酚類物質(zhì)在電氧化過程中形成了某些非電化學活性物質(zhì)，從而影響可逆反應(yīng)發(fā)生。增大烷基間苯二酚濃度，峰電流也隨之增大。

注：a為Na2HPO4-KH2PO4空白溶液；烷基間苯二酚濃度b為2.61×10-5 mol/L，c為3.92×10-5 mol/L。圖1 烷基間苯二酚在玻碳電極上的循環(huán)伏安圖

2.2 檢測條件的優(yōu)化

2.2.1 電解質(zhì)溶液的選擇

根據(jù)烷基間苯二酚的理化性質(zhì)，考察了幾種常見電解質(zhì)溶液，并利用循環(huán)伏安法記錄了烷基間苯二酚在磷酸緩沖溶液和0.1 mol/L高氯酸鋰的乙腈溶液中的電化學行為。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在有機電解質(zhì)及磷酸鹽緩沖溶液電解質(zhì)中烷基間苯二酚均出現(xiàn)氧化峰，無還原峰，且在0.1 mol/L高氯酸鋰的乙腈溶液中，烷基間苯二酚的氧化峰電位相對靠后，峰電流較小，而在磷酸鹽緩沖溶液中氧化峰電流比在有機電解質(zhì)更大，峰形更好。因此，烷基間苯二酚在磷酸鹽溶液中更易發(fā)生氧化反應(yīng)，而烷基間苯二酚本身幾乎不溶于水，溶于一些有機溶劑。甲醇極性較大，甚至對于一些鹽溶液都具有一些溶解能力。因此，選擇甲醇作溶劑，可以作為烷基間苯二酚與電解質(zhì)溶液之間的一種介質(zhì)，來增加烷基間苯二酚在磷酸鹽溶液中的溶解度，從而達到檢測目的。當待測樣品與鹽溶液配比小于1∶1時，混合溶液呈澄清狀態(tài)，有機溶劑對實驗結(jié)果無明顯影響可以采用該方法檢測，反之會有部分鹽析出，對實驗結(jié)果造成一定的影響。本實驗采用有機混合溶液(甲醇與待測樣品混合)與電解質(zhì)溶液配比為1∶3進行實驗。

注：a為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀溶液；b為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉溶液；c為磷酸氫二鈉-檸檬酸溶液(pH均為7)。圖2 不同電解質(zhì)對烷基間苯二酚的微分脈沖伏安曲線的影響

由圖2可知，在相同pH的不同電解質(zhì)溶液中，烷基間苯二酚的電化學行為相似，但峰電位、峰電流不同。圖2(a)的峰形最佳，為減小誤差，增大靈敏度，故選擇Na2HPO4-KH2PO4作為電解質(zhì)溶液。

2.2.2 pH的影響

利用微分脈沖伏安法研究了pH對烷基間苯二酚的峰電流的影響。由圖3可知，pH對氧化峰電流及氧化峰電位影響較大。當pH9時峰電流達到最高值，隨著pH的降低，烷基間苯二酚的氧化峰電位不斷正移，且氧化峰電流不斷減小，同時峰電位(Ep)與pH具有較好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Ep=1.195-0.078pH，R2=0.991。這表明該電氧化過程有質(zhì)子的參與，是一個質(zhì)子電子轉(zhuǎn)移的過程。由于該磷酸鹽緩沖溶液pH最大為9.18，故選擇pH9的Na2HPO4-KH2PO4作為電解質(zhì)溶液。

圖3 pH值對烷基間苯二酚的峰電流的影響

2.2.3 脈沖間隔和電位增量的影響

圖4、圖5研究了2.61×10-5mol/L的烷基間苯二酚在不同脈沖間隔和不同電位增量下的影響。如圖4、5所示，脈沖間隔與電位增量對峰電位幾乎無影響，但對峰電流及峰形影響較大。從圖4可以看出，隨著脈沖時間的縮短，峰電流不斷增大，峰寬也隨之改變，峰逐漸變寬；圖5中顯示，電位增量增大，峰電流逐漸增大，峰形逐漸變寬。為得到較好峰形，從而減小誤差，綜合考慮以上因素，選擇電參數(shù)條件：電位增量0.008 V，脈沖間隔0.3 s。

注：a-d表示脈沖間隔分別為0.3、0.5、1.0、1.2 s。圖4 脈沖間隔對烷基間苯二酚氧化峰電流的影響

注：a-d的電位增量分別為0.002、0.004、0.006、0.008 V。圖5 電位增量對烷基間苯二酚氧化峰電流的影響

2.3 標準曲線

圖6為在最佳測定條件下利用微分脈沖伏安法分別測定了0、2.5、5、10、15、20、50 μmol/L時對應(yīng)的曲線。由此可知，峰電流(Ip)隨烷基間苯二酚濃度的增加而增加，并在2.5～50 μmol/L范圍內(nèi)，烷基間苯二酚濃度與Ip呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為Ip=0.576 0+0.067 6C(Ip單位μA，C單位μmol/L)相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，最低檢測限為5.78×10-7mol/L(RSN=3)。

注：a-g表示烷基間苯二酚濃度依次為0、2.5、5、10、15、20、50 μmol/L。圖6 不同濃度烷基間苯二酚的微分脈沖伏安曲線圖

2.4 抗干擾性和穩(wěn)定性、重復性

在pH為9的Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液中，固定烷基間苯二酚濃度為2.61×10-5mol/L溶液進行抗干擾實驗，考察了小麥中常見的幾種離子和化合物。結(jié)果表明，100倍濃度的Na+、K+、Ca2+、Cl-、SO42-對其峰電流相應(yīng)值的影響均在3%以下；5倍濃度的谷氨酸在烷基間苯二酚掃描范圍內(nèi)無峰出現(xiàn)，并對其峰電流響應(yīng)值的影響僅為1.5%； 5倍濃度的抗壞血酸、生育酚、蘆丁均在電位為0.3 V之前有氧化峰，但對烷基間苯二酚峰電流影響均在3.5%以下，且峰電位無明顯變化。綜上所述，該電化學傳感器的抗干擾性較好。

采用微分脈沖伏安法對2.61×10-5mol/L的烷基間苯二酚進行重復性實驗，重復測定10次，其氧化峰電流響應(yīng)值相對標準偏差(RSD)為1.3%，表明該電化學傳感器具有較好的重復性。

分別配制3組(每組2個平行實驗)不同濃度的烷基間苯二酚標準溶液，并利用微分脈沖伏安法測定。結(jié)果顯示，3組的氧化峰響應(yīng)電流值的變化均在2.9%以下，說明該電化學傳感器具有較好的穩(wěn)定性。

2.5 紫小麥樣品中烷基間苯二酚的測定

將按1.3.3方法處理后的樣品提取液，分別采用電化學方法和紫外分光光度法檢測樣品中烷基間苯二酚的含量，并進行加標回收實驗，計算其平均值和相對標準偏差。結(jié)果如表1所示，本方法回收率在99.5%～102.0%之間，紫外分光光度法回收率在91.9%～94.2%。結(jié)果表明兩者檢測結(jié)果基本一致。另外，本方法的相對標準偏差較紫外分光光度方法小，表明本方法測定結(jié)果更加穩(wěn)定。

表1 紫小麥樣品中烷基間苯二酚加標回收率測定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究基于烷基間苯二酚在玻碳電極上的氧化還原特征，建立了一種特異性強、且快速靈敏的電化學傳感器。采用微分脈沖伏安法和快速循環(huán)伏安法對烷基間苯二酚在玻碳電極上的電化學行為進行分析并對其檢測條件進行了優(yōu)化。根據(jù)其循環(huán)伏安圖顯示，烷基間苯二酚在0.52 V處發(fā)生不可逆氧化反應(yīng)；利用微分脈沖伏安法對檢測條件進行優(yōu)化，根據(jù)其自身性質(zhì)探究電解質(zhì)溶液及電參數(shù)的選擇，最終確定最佳檢測條件為pH9的Na2HPO4-KH2PO4溶液作為電解質(zhì)溶液，電位增量0.008 V，脈沖間隔0.3 s；確定了烷基間苯二酚在玻碳電極上的氧化電流與其濃度之間的線性關(guān)系，同時該方法具有檢測限低(5.78×10-7mol/L)，靈敏度高，抗干擾性強且重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好等優(yōu)點。