葉賀霞　王子晴　王海濤

摘 要：整體柱是一種在色譜柱中進(jìn)行有機(jī)或無機(jī)原位聚合而成的固定相?；谡w柱在分離物質(zhì)和純化物質(zhì)方面有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)，所以對(duì)于整體柱的研究十分廣泛。本文主要介紹了溫敏性整體柱的制備方法以及溫敏性整體柱在抗菌、分離和藥物控釋等領(lǐng)域的應(yīng)用，通過具體實(shí)例的介紹展現(xiàn)了溫敏性整體柱的制備工藝簡(jiǎn)單、物質(zhì)分離效果良好和應(yīng)用寬廣的特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：溫敏;制備;物質(zhì)分離;藥物控釋

整體柱（monolithic column），也叫做連續(xù)床層，是通過單體、致孔劑、引發(fā)劑等組分聚集混合而成的細(xì)棒狀整體。在眾多領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，不僅制備方法簡(jiǎn)單而且具有良好的重現(xiàn)性、優(yōu)異的傳質(zhì)性能、擁有較高的柱效便于許多物質(zhì)的快速分離。整體柱材料在分離、合成等方面有著寬闊的運(yùn)用前景，吸引了眾多業(yè)內(nèi)相關(guān)人員的目光。

為滿足不同領(lǐng)域的應(yīng)用需求，人們提出了將溫敏性凝膠與整體柱有機(jī)結(jié)合的思想，繼而開發(fā)出溫敏性整體柱。溫敏性整體柱就是把溫敏水凝膠引入到整體柱中制備而成的。溫敏水凝膠屬于多功能的水凝膠的，它是可以在水中體積膨脹而不溶于水的高分子聚合物，對(duì)外部環(huán)境的溫度十分敏感，因其具有親水性和疏水性功能基團(tuán)，所以可以在水溶液作出逆轉(zhuǎn)性的體積膨脹變大或收縮變小。依據(jù)溫敏性水凝膠在不同溫度條件下的不同反應(yīng)，可將其分為熱脹和熱縮兩種類型的水凝膠。對(duì)于熱脹型水凝膠而言，當(dāng)外界溫度升高到一定臨界值時(shí)，水凝膠的體積會(huì)發(fā)生溶脹，溫度低于臨界值時(shí)，體積則呈現(xiàn)一定程度的收縮現(xiàn)象;而熱縮型水凝膠與之作用機(jī)制相反。將這種對(duì)水凝膠體積發(fā)生不同響應(yīng)的最低臨界溶解溫度稱為L(zhǎng)ow Critical Solution Temperature，簡(jiǎn)稱為L(zhǎng)CST。

聚-異丙基丙烯酰胺水凝膠就是溫敏性凝膠的一個(gè)重要的代表。水凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)中具有親水性和疏水性基團(tuán)，溫度較低時(shí)親水膨脹，溫度較高時(shí)疏水性基團(tuán)更加緊密結(jié)合，氫鍵作用力減弱而收縮。

1 溫敏性整體柱的制備

以NIPAM為單體為例，進(jìn)行溫敏性整體柱制備的敘述。人們常用引發(fā)劑引發(fā)聚合單體，并用交聯(lián)劑使其交聯(lián)來制備NIPAM整體柱。常用的引發(fā)劑有AIBN、APS、TEMED，常用的致孔劑有聚乙二醇、十二醇、1，4-丁二醇，常用的交聯(lián)劑有二甲基丙烯酸乙二酯（EGDMA）。

Liu等[1]以NIPAM作為單體，以APS與TEMED作為引發(fā)劑，以聚乙二醇作為致孔劑，利用冷凍聚合法制備了一種溫敏水凝膠整體柱。其以水為流動(dòng)相，可以通過調(diào)節(jié)柱溫對(duì)物質(zhì)進(jìn)行HPLC色譜分離，此方法簡(jiǎn)單易行，整體柱材料吸附性強(qiáng)，且具有較好的溫敏性能和分離富集性能。

胡耀強(qiáng)等[2]以NIPAM作為單體，以MBA作為交聯(lián)劑，以APS作為引發(fā)劑，采取乳液模板聚合法制備了溫敏性水凝膠整體柱。此反應(yīng)中乳液聚合的機(jī)制可以運(yùn)用均相成核的理論來闡釋。引發(fā)劑在水相中分解后與溶解在水相中的單體聚合，兩者聚合達(dá)到臨近界限的聚合鏈長(zhǎng)度后，低聚集的小分子物質(zhì)游離基便從水相中沉淀，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成核。實(shí)驗(yàn)表明，用乳液模板技術(shù)制備PNIPAM溫敏整體柱的過程較簡(jiǎn)單、容易操作、產(chǎn)物的溫敏效果更明顯。

2 應(yīng)用

基于溫敏性整體柱材料有很多優(yōu)點(diǎn)，如制備的工藝流程極其簡(jiǎn)單、內(nèi)部的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定均勻、重現(xiàn)性良好、分離效率高、靈敏度高等，最近這些年來，在物質(zhì)分離和藥物控釋以及抗菌領(lǐng)域有著廣泛的前景。

2.1 物質(zhì)分離

2.1.1 用于核酸的分離

Liu等運(yùn)用表面促使原子轉(zhuǎn)移自由基聚集連接的方式制備了一種溫敏性整體柱。這種整體柱是一種改性的二氧化硅柱，是由聚N-異丙基丙烯酰胺-2-二甲胺基甲基丙烯酸乙酯來接枝得到的。其作用機(jī)制是通過溫度來調(diào)節(jié)捕獲與釋放作用，能夠選擇性地分離和富集核苷酸（如腺苷核苷酸）和蛋白質(zhì)（如人或哺乳動(dòng)物的血清白蛋白）。除此之外，他們利用這種改性的色譜柱對(duì)人類的血清蛋白進(jìn)行了組學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明蛋白質(zhì)數(shù)量明顯提高。這體現(xiàn)了制備的溫敏材料在分離和富集蛋白質(zhì)方面有不容小覷的作用。

Feng等在制備氨基硅膠整體柱的時(shí)候使用了內(nèi)徑為100μm的毛細(xì)管，實(shí)現(xiàn)了在線SPE-CE系統(tǒng)，用于分離核酸DNA片段。此氨基硅膠整體柱被用于在線預(yù)富集濃縮，并將溫敏性材料PNIPAM作為篩選分離的基質(zhì)實(shí)現(xiàn)毛細(xì)管電泳（CE）分離。相較于傳統(tǒng)的毛細(xì)管電泳，這種氨基硅膠整體柱有如下優(yōu)點(diǎn)：①所有的DNA分子片段可得到更多的預(yù)濃縮因子，可達(dá)到100倍以上;②有較低的檢測(cè)限，可低至0123ng·mL-1;③可用來進(jìn)行痕量分析。作者細(xì)致分析了大腸桿菌（含有pUC19質(zhì)粒）的初步裂解的物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)表明了在線SPE-CE系統(tǒng)在繁雜生物樣品中的應(yīng)用，特別是在分析DNA方面展示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，以至于在生物藥物學(xué)界和生物醫(yī)學(xué)界有著極其重要而廣泛的應(yīng)用。

2.1.2 用于多肽及蛋白質(zhì)物質(zhì)的分離

因?yàn)槎嚯募暗鞍踪|(zhì)有分子量較大且具有較高生物活性的局限性，所以不適宜采用分離小分子的方法來對(duì)大分子的多肽及蛋白進(jìn)行分離、富集與純化。若要對(duì)大分子多肽及蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化，對(duì)流動(dòng)相有一定的要求，即使用低濃度的緩沖溶液。利用溫敏柱的溫敏特性，適當(dāng)改變溫度可以控制多肽及蛋白質(zhì)大分子在色譜整體柱上的去留，以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)等大分子的分離純化。H.Kanazawa采用了0.9%的NaCl緩沖溶液為流動(dòng)相，以溫敏性材料NIPAm和BMA的聚合物為色譜整體柱的固定相，成功地在40℃的溫度條件下對(duì)胰島素A鏈和胰島素B鏈以及β-內(nèi)啡膚片段進(jìn)行了分離。R.Zhang以NIPAm為單體制備出了聚N-異丙基丙烯酰胺溫敏性色譜整體柱，使用低濃度鹽溶液的不同濃度進(jìn)行梯度洗脫，并在適宜的溫度下成功分離出了六種蛋白質(zhì)大分子。

2.2 藥物控釋

隨著溫度的升高或降低，水凝膠的體積會(huì)隨之膨脹或收縮。利用水凝膠的此特性，可以在水凝膠內(nèi)部產(chǎn)生大量的不同大小的孔隙，從而可以作為藥物分子的載體，以達(dá)到藥物控釋的作用效果。為達(dá)到更好的藥物控釋效果，可以通過引入其他活性分子和敏感性基團(tuán)或單元對(duì)PNIPAM凝膠體系進(jìn)行修飾。

2.2.1 引入生物活性分子

Ma等將具有生物活性的親水性的聚乙烯亞胺分子（PEI）引入到PNIPAM溫敏水凝膠中，獲得了一種新型的藥物載體水凝膠模型。PEI分子的引入使水凝膠具備了以下優(yōu)點(diǎn)：①優(yōu)化了水凝膠的孔徑大小和結(jié)構(gòu);②改變了水凝膠的儲(chǔ)水量以及在低溫下水分的消耗速度。從而使得藥物的釋放速率在人的正常生理溫度下得到控制。Das等將具有生物活性的糊精引入到NIPAM溫敏水凝膠中，通過共價(jià)結(jié)合獲得了一種新型的溫敏性水凝膠釋放系統(tǒng)。從而可以調(diào)控一些藥物的釋放，如奧硝唑和環(huán)丙沙星，并可以保持長(zhǎng)達(dá)數(shù)月的穩(wěn)定性。

2.2.2 引入敏感性基團(tuán)

在聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠中接合一些特定的敏感性基團(tuán)，使聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠具有多種維度的敏感性。Garbern等將敏感性基團(tuán)PAA引入到NIPAM中，形成了P（NIPAM-co-PAA）聚合物這種水凝膠，此水凝膠不僅具有PH敏感性，也具有溫度敏感性。其作用機(jī)制為：由于組織病變，PH發(fā)生異常變化，此共聚物水凝膠發(fā)生凝膠化，存貯的藥物釋放，作用于病變組織;由于藥物的作用，使得PH重新回復(fù)到正常值，水凝膠又可隨之降解。這種水凝膠在特定的PH條件下釋放藥物，可以有針對(duì)性地治療某些疾病，如準(zhǔn)確地輸送藥物到達(dá)傷口或腫瘤等局部病變部位。該水凝膠是種可輸注、可降解的藥物控釋系統(tǒng)，目前相關(guān)研究正如火如荼地進(jìn)行。

2.3 抗菌

溫敏性水凝膠具有溫敏特性，其抗菌效果是通過藥物的緩控釋作用發(fā)揮的，并可以長(zhǎng)期保持?？咕z的作用機(jī)理是：當(dāng)外部環(huán)境的溫度達(dá)到或高于VPTT時(shí)，抗菌水凝膠產(chǎn)生體積相轉(zhuǎn)化，以釋放存儲(chǔ)其中的抗菌藥物?？咕z能夠使藥物在體內(nèi)停留較長(zhǎng)時(shí)間，延長(zhǎng)藥物的半衰期，保持藥物的抗菌效能，在眾多領(lǐng)域應(yīng)用較多。

3 結(jié)語

作為色譜柱的一種，溫敏性整體柱具有很多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，如制備的工藝流程極其簡(jiǎn)單、內(nèi)部的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定均勻、檢測(cè)限低、分離效率高、靈敏度高等，在物質(zhì)分離和藥物控釋以及抗菌領(lǐng)域有著廣泛的前景，本文對(duì)其制備過程以及應(yīng)用進(jìn)行了介紹。總體看來，溫敏性整體柱的應(yīng)用只在醫(yī)藥學(xué)方面被廣泛開發(fā)和研究，在其他方面卻少有涉及。此外，溫敏性整體柱仍然存在著其自身的局限性，對(duì)廣泛運(yùn)用于各種領(lǐng)域有著影響?？偠灾?，只要對(duì)其不斷地進(jìn)行深入研究和改善，溫敏性整體柱將眾多領(lǐng)域發(fā)揮出不可小覷的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]Liu M，Liu H，Liu Y，et al.Preparation and characteriza-tion of temperature-responsivepoly（N-isopropylacrylam-ide-co-N，N'-methylenebisacrylamide）monolith for HPLC[J].J Chromatogr A，2011，1218（2）：286-292.

[2]胡耀強(qiáng)，陳法錦，劉海寧，等.聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠的制備及熱致聚集行為[J].材料導(dǎo)報(bào)，2018，32（7）：2491-2496.

作者簡(jiǎn)介：葉賀霞（2001— ），女，漢族，河北邯鄲人，本科在讀，研究方向：制藥工程;王子晴（1999— ），女，漢族，河北保定人，本科在讀，研究方向：制藥工程;王海濤（2000— ），女，土家族，湖南吉首人，本科在讀，研究方向：制藥工程。