原曉龍, 王 毅, 楊文忠

(云南省林業(yè)和草原科學(xué)院，云南省森林培育與開發(fā)利用重點實驗室/國家林業(yè)和草原局云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育重點實驗室，云南 昆明 650201)

食用菌因其上佳的口感、柔軟的質(zhì)地和豐富的營養(yǎng)而廣泛地被人們所喜愛.青頭菌[Russulavirescens(Schff. ex Zart.) Fr.]是其中一種重要的野生食用菌.青頭菌又名綠菇，是一種紅菇科(Russulaceae)紅菇屬(Russula)擔(dān)子菌類真菌[1]，通常著生在闊葉或針葉樹種(如云南松等)根部形成外生菌根[2]，其子實體較大，味道濃郁鮮美、營養(yǎng)豐富[3]，長期以來被用作傳統(tǒng)中藥的民間藥方[4].目前關(guān)于青頭菌的分子生物學(xué)研究大多集中在系統(tǒng)進化、ITS鑒定[5]和DNA條形碼等[6]方面.青頭菌在成長過程中會產(chǎn)生戊基呋喃、辛酮和丁烯酮等聚酮類揮發(fā)性產(chǎn)物[3]，目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)青頭菌聚酮類化合物相關(guān)基因研究的報道.

大環(huán)內(nèi)酯類、蒽環(huán)類、四環(huán)素類和聚醚類天然聚酮化合物具抗感染、抗真菌、抗腫瘤和免疫抑制等活性，這些聚酮類化合物在臨床上被廣泛應(yīng)用[7]；聚酮類是由聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)催化合成的，聚酮合酶通過催化前體物質(zhì)進行反復(fù)的縮合反應(yīng)，可以形成多種聚酮體，再經(jīng)過甲基化、氧化還原、糖基化等修飾反應(yīng)形成各種各樣結(jié)構(gòu)復(fù)雜的聚酮類化合物[8].本研究通過對青頭菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的BLAST比對分析，獲得了一條PKS基因，通過RT-PCR克隆獲得該基因全長，并檢測了其在含不同碳氮源添加物培養(yǎng)基上的具體表達情況，以期為青頭菌品質(zhì)研究、及具生物活性聚酮類生物合成提供基礎(chǔ)材料.

1 材料與方法

1.1 青頭菌菌株分離

將采集于云南省宜良縣的青頭菌帶回實驗室后，采用組織分離法，在無菌環(huán)境下將新鮮子實體的菌柄、菌蓋等不同部位的組織分離出來，切成小塊，置于PDA斜面培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫環(huán)境培養(yǎng).長滿管后，轉(zhuǎn)接2次平板，純化菌絲.純化后的菌絲經(jīng)形態(tài)鑒定，及ITS(GenBank登錄號MW307354)、β-tubulin(GenBank登錄號MW307355)和elongation factor 1α(GenBank登錄號：MW307356)鑒定后，該菌種為青頭菌(R.virescens)，并將該菌株命名為Rv-yaf-001.

1.2 試劑與儀器

真菌RNA提取試劑盒(康為世紀公司)，高保真DNA聚合酶(TaKaRa公司)，NanoDropTM2000紫外分光光度計(賽默飛世爾科技公司)，真菌總RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛世爾科技公司)，DNA純化試劑盒(Qiagen公司)，無縫克隆試劑盒(Biomiga公司).

1.3 RvPKS基因的挖掘和分離

首先以曲霉中已報道過的PKS基因為模板，利用本地BLAST對青頭菌基因組進行掃描，獲得可能含有PKS基因的contigs，然后利用antiSMASH(https://antismash.secondarymetabolites.org/)軟件進行驗證，并利用GENEFISH對contigs進行開放閱讀框掃描，通過生物信息學(xué)分析獲得青頭菌基因組中RvPKS基因的DNA序列以及蛋白序列.

根據(jù)DNA序列設(shè)計含起始密碼子的特異引物RvPKSF:5′-ATGGAACATCTGAATATCCC-3′，及含終止密碼子的特異引物RvPKSR:5′-ACGGCCTCTGCAATAATTGA-3′，以青頭菌cDNA為模板，用HiFi高保真DNA聚合酶用于RvPKS基因全長cDNA的克隆；經(jīng)DNA純化試劑盒將該片段純化后，并將其連接到克隆載體Peasy-T3上，轉(zhuǎn)化到Trans-T1感受態(tài)細胞中.37 ℃培養(yǎng)24 h，進行菌落PCR后選擇含有插入片段的陽性克隆送到上海生工進行測序.

1.4 生物信息學(xué)分析

應(yīng)用ExPASy數(shù)據(jù)庫(https://www.expasy.org/)中的ProtParam、SignalP、TargetP、Prosite和TMHMM對RvPKS蛋白對其理化性質(zhì)、信號肽、細胞定位、保守結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域進行分析.并從美國生物技術(shù)信息中心(NCBI)上選擇功能已知且鑒定過化合物的蛋白序列用于聚類分析，采用MEGA 7.0中的Clustal W程序?qū)λx擇的PKS蛋白序列和青頭菌中的RvPKS蛋白序列進行比對后，采用鄰位相接法(Neighbor-joining)，自檢舉1 000次，其余采用默認參數(shù)構(gòu)建分子系統(tǒng)進化樹.依據(jù)聚類結(jié)果，從基因起源與功能分化的角度預(yù)測該基因功能，并進一步推測該基因產(chǎn)生的聚酮化合物.

1.5 RvPKS基因在不同培養(yǎng)基上的表達

根據(jù)RvPKS基因的DNA序列設(shè)計特異檢測引物(TRvPKSF:5′-AGAATCGCTTCAGAGTTG-3′, TRvPKSR:5′-ATGAACACCGAGTATCAC-3′).然后將青頭菌菌種培養(yǎng)在不同含量的碳源添加物培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d后，從每種培養(yǎng)基上收獲0.5 g菌絲體，重復(fù)3次取樣，提取總RNA并選擇完整性較好和濃度合適的轉(zhuǎn)錄成cDNA.以MYA為基本培養(yǎng)基，分別添加2%和10%的葡萄糖、山梨醇、蔗糖、肌醇、麥芽糖、甘露醇和可溶性淀粉.然后以actin為陽性對照，采用RT-PCR以特異引物TRvPKSF和TRvPKSR檢測該基因的具體表達情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 RvPKS基因的全長cDNA克隆

RvPKS基因的克隆測序結(jié)果(圖1)顯示，該基因(GenBank登錄號MT655136)的全長cDNA含有6 039 bp，可編碼氨基酸2 012個；保守結(jié)構(gòu)域分析顯示該基因的蛋白結(jié)構(gòu)域組織為：ACP?；D(zhuǎn)移酶(SAT)-β酮基合成酶(KS)-酰基轉(zhuǎn)移酶(AT)-?；d體蛋白(ACP)-硫酯酶釋放結(jié)構(gòu)域(TE).將該基因的cDNA全長于NCBI上進行BLASTN比對，未發(fā)現(xiàn)與該基因同源的基因；將其蛋白序列進行BLASTP比對發(fā)現(xiàn)，該蛋白與易碎軟齒菌(Dentipellisfragilis)的PKS(TFY72602.1)蛋白序列擁有最高的相似性，但其相似度僅為49.03%，說明該基因為尚未報道的PKS基因.

M：maker.圖1 RvPKS基因全長cDNA的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the full-length cDNA of the RvPKS gene

2.2 RvPKS蛋白的生物信息學(xué)分析

RvPKS蛋白分子質(zhì)量為219.03 ku，理論等電點(pI)5.89，分子式為C9748H15372N2656O2910S8，其由2 012個氨基酸殘基組成，其中亮氨酸(Leu)、絲氨酸(Ser)和丙氨酸(Ala)為該蛋白中含量最高的3個氨基酸，酸性氨基酸數(shù)量191個，堿性氨基酸155個；該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)(Ⅱ)是41.02，屬于不穩(wěn)定蛋白；其脂肪族氨基酸系數(shù)為97.09，親水性平均系數(shù)(GRAVY)為0.061.經(jīng)保守結(jié)構(gòu)域分析表明，該蛋白含有SAT-KS-AT-ACP-TE等結(jié)構(gòu)域，其中各結(jié)構(gòu)域的保守活性氨基酸序列(圖2)為SAT(GIIGFSSGII)，KS(DTACSSSL)、AT(NVVEAHGTGTQ)、ACP(VVGHSLGEYVA)和TE(LGGWSLGGIIA)(粗體字代表高度保守氨基酸).SignalP-5.0預(yù)測顯示RvPKS蛋白無信號肽存在，TargetP 2.0預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白定位于細胞質(zhì)基質(zhì)；SOPMA預(yù)測顯示該蛋白組成α螺旋的氨基酸有813個、β折疊289個、β轉(zhuǎn)角87個、無規(guī)則卷曲823個，分別占蛋白質(zhì)氨基酸總數(shù)的40.41%、14.36%、4.32%和40.90%(圖3).青頭菌RvPKS蛋白與其他真菌PKS蛋白的聚類分析結(jié)果顯示(圖4)，該聚類樹分為5個分支，其中火絲菌(Pyronemaomphalodes, GenBank登錄號：CCX04910)、雞樅菌屬(Termitomycessp., GenBank登錄號：KNZ72615)、白環(huán)菇屬(Leucoagaricussp., GenBank登錄號：KXN83388)、烏氏曲霉(Aspergillusudagawae, GenBank登錄號：GAO84443)、絲曲霉(Aspergilluslentulus, GenBank登錄號：GFG17843)、Penicilliumsubrubescens(GenBank登錄號：OKP10856)和青頭菌PKS蛋白聚為一支，其結(jié)構(gòu)域組織順序為SAT-KS-AT-ACP-TE，含有非還原型PKS的結(jié)構(gòu)域SAT，即該蛋白編碼非還原型PKS；該分支中烏氏曲霉的PKS(GenBank登錄號：GAO84443)[9]、火絲菌的PKS(GenBank登錄號：CCX04910)[10]其蛋白產(chǎn)物為聚酮合酶，生物合成的產(chǎn)物為分生孢子色素，青頭菌RvPKS基因的終產(chǎn)物可能為分生孢子色素.

RvPKS：青頭菌PKS(Russula virescens)；DePKS：軟齒菌屬PKS(Dentipellis sp., GenBank登錄號：KAA1469652.1)；GtPKS：密褐褶孔菌PKS(Gloeophyllum trabeum, GenBank登錄號：XP_007866703.1)；HsPKS：小側(cè)溝香菇(Heliocybe sulcata, GenBank登錄號：TFK52663.1)；AgPKS：法國蜜環(huán)菌(Armillaria gallica, GenBank登錄號：PBK92884.1)，*表示豎列中的氨基酸完全一致，表示豎列中的氨基酸有3個以下的差異.圖2 青頭菌RvPKS蛋白各結(jié)構(gòu)域的保守活性位點Fig.2 Conserved active amino acids sites of the RvPKS proteins in R.virescens

圖3 RvPKS蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.3 Prediction of the RvPKS protein tertiary structure

圖4 青頭菌RvPKS蛋白與其他真菌PKS蛋白的聚類分析Fig.4 Phylogenic analysis of the RvPKS in R.virescens and PKS proteins from other fungus

2.3 RvPKS基因的表達分析

RT-PCR結(jié)果顯示(圖5)：該基因在2%碳源含量條件下，添加山梨醇的培養(yǎng)基中，該基因表達量最高，后面從高到低依次為麥芽糖>葡萄糖>肌醇>蔗糖>甘露醇>可溶性淀粉；RvPKS基因在10%碳源含量條件下，表達量從高到低依次為蔗糖>葡萄糖>山梨醇>麥芽糖>甘露醇>肌醇>可溶性淀粉.說明該基因受不同含量糖類的誘導(dǎo)表達程度不同，但可溶性淀粉均不能強烈誘導(dǎo)該基因表達.

圖5 RvPKS基因在含不同碳源添加物培養(yǎng)基上的基因表達情況Fig.5 Relative expression of the RvPKS gene under mediums supplemented with various carbon sources

3 討論

目前，關(guān)于青頭菌的研究主要集中在青頭菌冷凍工藝[11]、化學(xué)成分[12,13]、子實體多糖的理化性質(zhì)[14]、系統(tǒng)發(fā)育和ITS鑒定[15,16]、系統(tǒng)分類等方面，而關(guān)于青頭菌中聚酮類化合物及其基因的研究尚未見報道.本研究以青頭菌的基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，分離獲得一條PKS基因，生物信息學(xué)分析顯示該基因的蛋白序列含有SAT-KS-AT-ACP-TE，其中SAT結(jié)構(gòu)域為非還原型PKS特有的結(jié)構(gòu)域[17]；與其它真菌進行比較，發(fā)現(xiàn)各結(jié)構(gòu)域含有保守氨基酸序列，分別為SAT[G(I/V)(I/L)GFSSGI(I/L)]，KS(DTACSSS)、AT(HGTGT)、ACP(VVGHSLGEY)和TE(GGWSLGG)[18,19]；同時該蛋白含有KS-AT-ACP這3個聚酮合酶的最基本結(jié)構(gòu)域[20]；分子系統(tǒng)進化樹顯示與青頭菌RvPKS蛋白聚為一支的其他真菌，其結(jié)構(gòu)域組織順序均為SAT-KS-AT-ACP-TE；且其中烏氏曲霉的PKS(GenBank登錄號：GAO84443)[9]、火絲菌的PKS(GenBank登錄號CCX04910)[10]的終產(chǎn)物為分生孢子色素.這些證據(jù)均表明青頭菌RvPKS基因編碼非還原型PKS酶，其終產(chǎn)物可能為分生孢子色素.

青頭菌是一種與闊葉樹或針葉樹的根部共生的外生菌根菌，需要供給其合適的營養(yǎng)成分和生長條件才能使其孢子萌發(fā)、菌絲生長[21].離體培養(yǎng)時，不同的培養(yǎng)基會影響青頭菌菌種的菌絲生長速度[22]，青頭菌子實體中多糖含量成分較高，其單糖組分主要包括葡萄糖、甘露糖和果糖等[14]；同時滲透壓、不同碳氮源和不同含量的碳氮源添加物能影響真菌中聚酮類次生代謝產(chǎn)物和PKS基因的表達，如10%含量的山梨醇、2%和10%含量的蔗糖均能夠促使長松蘿中UlPKS基因的大量表達[23].因此，本研究在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，添加不同種類和濃度的碳源添加物以研究碳源添加物對RvPKS基因表達的影響.結(jié)果表明，不同含量的碳源添加物對該基因表達影響差異顯著，其中在2%碳源含量條件下，山梨醇對該基因的表達的影響最為強烈；在10%碳源含量條件下，蔗糖對該基因表達的影響最為強烈.這種同一基因在不同培養(yǎng)條件下表達量明顯差異的現(xiàn)象是因其受到滲透壓、培養(yǎng)基成分和酶抑制劑等的影響，使同一蛋白酶受到正或負反饋，進而進入不同的代謝通路，產(chǎn)生不同的次級代謝產(chǎn)物，是一種通過微生物基因組數(shù)據(jù)挖掘獲得骨架新穎、活性不同的次級代謝產(chǎn)物的有效途徑[24,25].本研究以基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，結(jié)合生物信息學(xué)分析成功分離得到一條青頭菌的RvPKS基因，并對其功能進行預(yù)測分析，并檢測該基因在不同碳源條件下的具體表達，為鑒定和異源表達青頭菌中聚酮合酶基因提供依據(jù).