黃彥菱, 姜雅淇， 李小意, 李高明, 楊 毅

(1.四川大學生命科學學院 生物資源與環(huán)境教育部重點實驗室, 成都 610065;2.四川大學文學與新聞學院， 成都 610065)

1 引 言

植物不能像動物那樣通過遷移來尋找適宜的生存環(huán)境，因此，為了能夠在不斷變化的環(huán)境中生存，植物通常會被不同的環(huán)境馴化出一系列的調控機制[1].在遭遇干旱、冷凍、鹽堿等逆境脅迫時，植物的各種內源激素便單獨或協(xié)同地發(fā)揮重要作用以應對這些非生物脅迫[2].植物在干旱時，體內ABA含量迅速增加，進而激活ABA信號通路，合成干旱相關基因的表達，或通過抑制氣孔開放以降低植物的蒸騰作用，從而使其更好地應對干旱脅迫.此外，ABA參與調節(jié)植物生長發(fā)育的諸多過程，能夠遲滯種子的萌發(fā)，抑制植物的生長[3-4].

ABA通路中三大核心元件包括：ABA受體(Regulatory Components Of ABA Receptors/Pyrabactin Resistance/ PYR Like, RCAR/PYR/PYL)、SNF1相關聯(lián)的蛋白激酶(SNF1-Related Protein Kinases, SnRK2s)和下游的轉錄因子.ABA存在時，在ABA受體與ABA結合后，抑制蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase 2Cs, PP2Cs)的活性，從而釋放了對SnRK2s的抑制[5-6].SnRK2s自我磷酸化后，激活其磷酸激酶活性，磷酸化離子通道蛋白，控制對滲透脅迫的適應性反應[7].ABA受體除了響應ABA應答外，也會參與到植物對其它非生物脅迫的應答.近期研究表明，在擬南芥中過表達RCAR12或RCAR13 后，經過高溫或者冷凍處理，與野生型的擬南芥相比，其存活率明顯較高，揭示了RCAR12和RCAR13可能在擬南芥對極端溫度的響應方面發(fā)揮了積極作用[8].在小麥中，TaOPR1(12-Oxo-Phytodienoic Acid Reductase 1)通過ABA信號通路調控逆境因子MYC2(Myelocytomatosis 2), 從而提高了小麥對鹽的耐受性[9].因此，研究植物對ABA的響應有利于提升農作物對非生物脅迫的適應性，對指導農業(yè)生產具有重要意義.

本實驗先前以擬南芥中的ABA受體RCAR3/PYL8為誘餌篩選到CARK1，熒光雙分子互補實驗和酵母雙雜交實驗證明：該激酶分別與RCAR3、RCAR11、RCAR12、RCAR13、RCAR14在體內外均有較強的相互作用，并且能夠磷酸化它們[10].根據(jù)蛋白質同源性分析，除CARK1外，該家族還擁有10個同源蛋白，分別命名為CARK2-11，同時將該家族分為三個亞家族，其中CARK4為Ⅲ亞家族，CARK5-9為Ⅱ亞家族，剩下的均為Ⅰ亞家族.前期的研究證明了CARK1通過磷酸化ABA受體從而正調控ABA信號的傳遞.因此，通過對CARK家族單突變體和雙重突變體的分析，探究CARKs是否全部參與ABA信號的調控，且在ABA信號途徑.

2 材料與方法

2.1 材 料

cark1,cark2,cark4,cark5,cark6,cark7,cark11七種T-DNA插入突變體從擬南芥生物資源中心(ArabidopsisBiological Resource Center, ABRC)購買，背景為哥倫比亞野生型(Col-0)，詳細信息見表1.鑒定引物根據(jù)突變體種子編號在http://signal.salk.edu/index.html中查找，引物由北京擎科公司合成.

表1 carks突變體信息

2.2 方 法

2.2.1 擬南芥基因組的提取和PCR擴增 本實驗用Plant Genomic DNA Extraction Kit試劑盒(Biovision).取1 cm2左右的擬南芥嫩葉片，加液氮磨碎，然后加buffer A 400 μL；65 ℃加熱10 min，離心10 min，轉移上清，加400 μL buffer B混勻；離心10 min，加400 μL buffer C洗滌后離心去廢液，加適量buffer D溶解.以提取的基因組DNA為模板，加入引物和2×T5 Super PCR Mix(北京擎科)，PCR擴增檢測條帶.

2.2.2 擬南芥的雜交 為了獲取雙重突變體，當單基因突變體擬南芥開花期時，選擇剛冒白的花朵，除去多余部分，只留柱頭.將父本的花粉抖到柱頭上，用套子覆蓋，第二天重復此授粉過程.由此獲得的雜交種子用于雙重突變體的PCR篩選和鑒定.

2.2.3 ABA抑制的種子萌發(fā) 用MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)種子，ABA處理的濃度為0.3、0.5和1 μmol/L，分別統(tǒng)計萌發(fā)的種子數(shù)和總數(shù)，間隔12 h統(tǒng)計一次，并計算萌發(fā)率，生物學重復三次.

2.2.4 ABA抑制的綠芽率 用MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)種子，ABA處理的濃度為0.3、 0.5和1 μmol/L.待種子萌發(fā)后，每隔24 h統(tǒng)計種子子葉變綠的個數(shù)和種子總數(shù)，并計算百分率，生物學重復三次.

3 結 果

3.1 carks突變體的鑒定

PCR鑒定結果表明成功構建了十種雙重突變體，如圖1所示，左上角第一個株系是雙重突變體cark1cark4，記為cark1/4.同理，其余九種雙重突變體分別記為cark1/7、cark1/11、cark4/5、cark4/7、cark4/11、cark5/7、cark5/11.提取構建的雙重突變體擬南芥的基因組為模板，進行PCR擴增.其中引物LP和RP分別位于T-DNA插入位點的兩端，LP為正向引物，RP為反向引物，LB1.3為插入到擬南芥基因組上的T-DNA載體片段的末尾端，且為正向引物.用LP+RP這對引物能擴出條帶時，表明沒有T-DNA插入；用LB1.3+RP這對引物能擴出條帶時，表明有T-DNA插入.所以，用這兩對引物同時擴增一個模板時，如果只出現(xiàn)LP+RP的條帶，表明是野生型；若只出現(xiàn)LB1.3+RP的條帶，表明是突變體；若兩者皆有條帶，則是雜合植株.由此觀之，上述雙重突變體的純合植株已全部構建成功.

圖1 carks雙重突變體基因組的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of carks double mutant plants

3.2 ABA抑制的種子萌發(fā)和子葉變綠分析

在種子萌發(fā)和子葉變綠階段，cark1、cark4、cark5、cark6單基因突變體相較于野生型對ABA不敏感，如圖2所示.在MS固體培養(yǎng)基上，cark1、cark4、cark5、cark6突變體和野生型的萌發(fā)趨勢基本一致(圖2a)，而用ABA處理后(圖2b～d)，雖然所有株系的萌發(fā)都被抑制，但cark1、cark4、cark5、cark6突變體的萌發(fā)率均較野生型高.用0.3 μmol/L的ABA處理所有株系7 d后，野生型的綠芽率只有22%左右(圖2e、f)，而cark1為76%，cark4為62%，cark5為39%，cark6為46%左右.以上結果表明，CARK1、CARK4、CARK5、CARK6在ABA介導的抑制種子萌發(fā)和子葉變綠中起著正調控作用.

圖2 carks單基因突變體在種子萌發(fā)和子葉變綠時對ABA的敏感分析(Ⅰ) ** P<0.01.Fig.2 carks single gene mutant plants were insensitive to ABA in ABA-mediated seed germination and green shoots (Ⅰ) ** P<0.01.

圖3 carks單基因突變體在種子萌發(fā)和子葉變綠時對ABA的敏感分析(Ⅱ) **P<0.01.Fig.3 carks single gene mutant plants were insensitive to ABA in ABA-mediated seed germination and green shoots (Ⅱ) ** P<0.01.

相似地，在種子萌發(fā)和子葉變綠時期，cark7、cark11單基因突變體相較于野生型對ABA不敏感，如圖3所示.在MS固體培養(yǎng)基上，cark7、cark11突變體和野生型的萌發(fā)基本一致(圖3a).用0.3 μmol/L ABA處理后(圖3.3b-d)，cark7、cark11突變體的萌發(fā)率均比野生型高，差異均較大.用0.3 μmol/L的ABA處理8 d后，野生型的綠芽率為35%左右(圖3e、f)，而cark7為92%，cark11為78%.以上結果表明CARK7和CARK11功能缺失的株系在ABA介導的抑制種子萌發(fā)和子葉變綠時對ABA不敏感.

圖4 carks雙重突變體在種子萌發(fā)和子葉變綠時對ABA的敏感性分析(Ⅰ) **P<0.01.Fig.4 carks double mutant plants were insensitive to ABA in ABA-mediated seed germination and green shoots (Ⅰ) ** P<0.01.

cark1/4、cark1/7、cark1/11雙重突變體在種子萌發(fā)和子葉變綠階段相較于野生型對ABA極不敏感，如圖4所示.cark1/4、cark1/7、cark1/11雙重突變體和野生型的萌發(fā)在不處理時幾乎一致(圖4a).用ABA處理時(圖4b～d)，cark1/4、cark1/7、cark1/11雙重突變體的萌發(fā)率均比野生型高，且差異均較大.用0.5 μmol/L的ABA處理全部株系，10 d后，野生型的綠芽率只有13%左右(圖4e、f)，而cark1/4為88%，cark1/7為91%，cark1/11為78%.其余的雙重突變體cark4/5、cark4/7、cark4/11、cark5/7、cark5/11在萌發(fā)和子葉變綠時同樣對ABA不敏感，如圖5所示.無處理時，上述雙重突變體和野生型的萌發(fā)率保持一致(圖5a).用ABA處理時(圖5b～d)，cark4/5、cark4/7、cark4/11、cark5/7、cark5/11雙重突變體的萌發(fā)率均比野生型高，且差異均很大.用0.5 μmol/L的ABA處理10 d，野生型的綠芽率為20%左右(圖5e、f)，而cark4/5、cark4/7、cark4/11、cark5/7、cark5/11則分別為81%、89%、76%、79%、85%.以上結果表明，carks雙重突變體在種子萌發(fā)和子葉變綠階段對ABA的不敏感性強于carks單突變體.

圖5 carks雙重突變體在種子萌發(fā)和子葉變綠時對ABA的敏感性分析(Ⅱ) **P<0.01.Fig.5 carks double mutant plants were insensitive to ABA in ABA-mediated seed germination and green shoots (Ⅱ) ** P<0.01.

4 討 論

截至目前，已經發(fā)現(xiàn)了四個激酶能磷酸化ABA受體.但是它們的功能以及對ABA信號通路的影響是不同的.在正常情況下，TOR(Target of Rapamycin)磷酸化RCAR12的S119位點, 抑制ABA信號通路；在脅迫下，SnRK2s磷酸化TOR的一個亞基Raptor, 從而抑制TOR的激酶活性[11].隨后研究者又發(fā)現(xiàn)，激酶AEL(ArabidopsisEL1-like)分別磷酸化RCAR11的S109和S156，RCAR12的S136和S182的位點，促進泛素化修飾，從而加劇降解，因此AEL在ABA信號通路中起負調控作用[12].質膜磷酸激酶CEPR2(C-terminally encoded peptide receptor 2)磷酸化被募集到質膜上的RCAR10的S54, 促進RSL1泛素連接酶對RCAR10的泛素化，進而促進26S蛋白酶對其降解[13].本研究的蛋白質磷酸激酶CARK1磷酸化RCAR3的T77位點和RCAR11的T78位點.由此可見，ABA受體不同位點被磷酸化導致其對ABA信號途徑的影響不同，從而形成了復雜的調控網(wǎng)絡，以應對多變的生態(tài)環(huán)境.

carks單基因突變體cark1、cark4、cark5、cark6、cark7和cark11在種子萌發(fā)和子葉變綠階段相對于野生型對ABA不敏感(圖2和圖3)，carks雙重突變體cark1/4、cark1/7、cark1/11、cark4/5、cark4/7、cark4/11、cark5/7和cark5/11同樣也在萌發(fā)和子葉變綠階段相較于野生型對ABA不敏感，且這種不敏感性強于單基因突變體(圖4和圖5)，這說明CARKs家族成員在ABA信號途徑中的功能是冗余的.實驗室前期的工作表明CARK1能夠磷酸化ABA受體[6-7]，所以以CARKs基因功能缺失的突變體為材料，探究這些突變體在ABA處理下的表型，從而探討CARKs在ABA信號通路中的作用.在預實驗中，由于cark2株系在萌發(fā)時對ABA的耐受性與野生型差異較小，因此在構建雙重突變體時未將其作為重點.

結果表明，CARKS存在功能冗余性，接下來可以通過體內外蛋白質互作的方法分析不同的CARK是否會與相同的ABA受體存在相互作用，進而用體外磷酸化實驗分析這些CARKs激酶是否磷酸化相同的ABA受體，或者分析這些CARKs激酶在體內對相同的ABA受體穩(wěn)定性的影響.如果實驗結果表明不同的CARKs激酶會磷酸化相同的ABA受體，并且會影響其體內的蛋白水平，那么就找到了其存在功能冗余性的原因.研究CARKs在ABA信號通路中的功能有助于為研究植物應對逆境時的調節(jié)機制提供新思路，提升農作物對逆境的適應性，并最終提高農作物的產量.