李孝剛，彭曙光，靳志麗，周 羽，劉勇軍，周志高，王興祥?

（1. 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京林業(yè)大學生物與環(huán)境學院，南京 210037；2. 湖南省煙草科學研究所，長沙 410004；3. 中國科學院南京土壤研究所，南京 210008；4. 湖南省煙草公司永州市公司，湖南永州 425000）

土壤是優(yōu)質(zhì)煙系統(tǒng)工程的基礎(chǔ)，是影響烤煙品質(zhì)的首要環(huán)境因素。土壤有機質(zhì)影響著土壤的其他理化性質(zhì)以及微生物活性，是反映土壤肥力和地力的重要指標[1-2]。對于一般農(nóng)作物而言，土壤有機質(zhì)含量越高，土壤肥力性狀越好，作物越容易獲得高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。但對于烤煙而言，由于其特殊的需氮規(guī)律，土壤有機質(zhì)含量過高或過低對烤煙生長與品質(zhì)均不利[3]。土壤有機氮有效化的主要途徑是有機質(zhì)的礦化和分解過程，礦化形成的無機氮是煙株氮營養(yǎng)的主要來源。其中，烤煙在整個生育期均表現(xiàn)出對硝態(tài)氮偏向吸收的特性，是烤煙氮素吸收的最主要形式，而銨態(tài)氮肥效相比硝態(tài)氮表現(xiàn)出一定的滯后性，且吸收積累量相對較少。因此，如何協(xié)調(diào)土壤的供氮特征，使之與烤煙生長需氮要求相匹配，有效改善植煙區(qū)優(yōu)質(zhì)煙葉的產(chǎn)率，成為煙草行業(yè)所面臨的巨大挑戰(zhàn)。

土壤氮素的供應(yīng)與烤煙需氮規(guī)律的協(xié)調(diào)性是決定烤煙品質(zhì)的關(guān)鍵因素[4]。一般認為土壤氮礦化量與土壤有機質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，土壤有機質(zhì)含量過高并不利于煙葉品質(zhì)的形成。原因在于，煙株生長后期土壤中依然能礦化出較多的無機氮，煙株貪青晚熟，煙葉不易正常落黃，吃味辛辣，可用性差[3]。然而，有機物料組成影響土壤有機氮礦化速率，其中碳氮比（C/N）是調(diào)控土壤有機氮礦化的重要因子[5-6]。目前，施用有機糞肥、餅肥、秸稈還田和種植綠肥等改善植煙土壤結(jié)構(gòu)和養(yǎng)分供應(yīng)的技術(shù)措施，在不同植煙區(qū)提升煙葉產(chǎn)質(zhì)的生產(chǎn)實踐效果往往不一，這可能與不同植煙區(qū)土壤性狀存在顯著差異有關(guān)[7]。土壤微生物是驅(qū)動土壤有機物質(zhì)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的主要動力，外源有機物料的投入改變了土壤微生物生長所需能量物質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量，進而影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及活性[8]，相應(yīng)地會導致土壤養(yǎng)分供應(yīng)尤其是氮素礦化特征的差異[9]。

湖南烤煙種植主要分布于湘南和湘西北兩個生態(tài)區(qū)域，分別以煙-稻輪作及旱煙為主。本研究采集上述煙區(qū)典型植煙土壤，選擇稻草、油菜、黑麥草及菜籽餅等C/N 不同的有機物料類型，開展室內(nèi)培育試驗，以揭示如下科學問題：（1）有機物料施入下高、低有機質(zhì)土壤無機氮礦化特征和微生物功能活性響應(yīng)差異，（2）不同C/N 有機物料施入對土壤無機氮礦化和微生物功能活性的影響，（3）有機物料施入下土壤氮素礦化的微生物機制。研究結(jié)果將為湖南煙區(qū)制定科學合理的有機物料施用制度、提高烤煙產(chǎn)質(zhì)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤及有機物料

分別在湖南省湘南植煙區(qū)和湘西植煙區(qū)選擇典型煙田，湘南植煙土壤采自永州市藍山縣土市鎮(zhèn)植煙水稻土（YZ，25°31′29.3″N，112°13′42″E），湘西植煙土壤采自湘西自治州花垣縣道二鄉(xiāng)植煙旱地（XX，28°31′25″N，109°27′28″E）。于2016 年5 月，按照多點取樣法在選定的標準煙田采集0～20 cm土壤，帶回實驗室用于培育實驗研究。將土壤中的石塊以及植物殘體（如根系）剔除后，風干過篩（10目）待用。取一部分研磨后過100 目篩孔，用于土壤理化性質(zhì)測定（表1）。

供試有機物料選取成熟油菜秸稈（YC）、稻草（DC）、成熟黑麥草（HMC）和菜籽餅（CZB），為當?shù)責焻^(qū)常用的幾種有機物料。各有機物料烘干、粉碎、碾磨，過40 目篩待用，其基本性質(zhì)見表2。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Physico-chemical properties of the soils in the study

表2 各有機物料碳氮比Table 2 Carbon to nitrogen ratios of the organic materials tested

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置稻草、油菜、菜籽餅、黑麥草以及對照（不添加物料，CK）5 個處理，每個處理3 次重復。各有機物料添加量均按純 N 100 mg·kg-1土壤進行折算。稱取50 g 風干土，不同處理中添加的有機物料與土壤充分混勻后，置于150 mL 三角瓶培養(yǎng)，用蒸餾水調(diào)節(jié)含水量至 60%田間最大持水量，于25 ℃恒溫培養(yǎng)60 d，每隔3 d 采用恒重法補充蒸發(fā)的水分。培養(yǎng)過程中共設(shè)置180 個培養(yǎng)裝置（三角瓶），用于在培養(yǎng)的第7、14、21、31、60 天開展破壞性采樣，測定土壤銨態(tài)氮與硝態(tài)氮含量。在第14、31 天采樣中，取部分樣品用于測定土壤脲酶、蔗糖酶，并對31 d 采集的土壤樣品分析土壤微生物群落功能多樣性。

1.3 分析方法

有機物料總碳用重鉻酸鉀容量法測定，全氮用凱氏法測定。土壤樣品的用 2 mol·L-1的KCl 浸提，靛酚藍比色法測定；用1 mol·L-1的KCl 浸提，220 nm/275 nm 雙波長紫外分光光度法[10]測定。土壤脲酶用靛酚藍比色法測定，轉(zhuǎn)化酶用3，5-二硝基水楊酸比色法[11]測定。

采用BIOLOG 生態(tài)板（Eco microplate，Matr ix Technologies Corporation，美國）分析法測定不同處理土壤微生物群落功能的多樣性。主要步驟[12]為：稱取相當于5 g 風干土壤的新鮮土壤樣品加入盛有45 mL 滅菌的生理鹽水（0.85%）三角瓶中，室溫振蕩30 min 后靜置。吸取1 mL 土壤懸浮液至9 mL 無菌生理鹽水中，混勻，用排槍將10-3稀釋液均勻加至96 孔生態(tài)板，25℃恒溫避光培養(yǎng)，0、24、48、72、96、120、144、168、192和 216 h 后在590 nm、750 nm 波長下測定吸光度值（OD）。

1.4 指標計算

不同有機物料處理下各時段土壤表觀硝化速率=（各時段土壤N含量—初始土壤N含量）/培養(yǎng)天數(shù)。

對于BIOLOG 數(shù)據(jù)，培養(yǎng)72h的微生物生長代謝處于旺盛時期，因此選取培養(yǎng)時間72h的試驗結(jié)果進行分析，利用平均顏色變化率（AWCD）來反映土壤微生物活性。計算公式為：AWCD=∑（C590-C750）/31，式中，C590、C750 分別為590、750 nm 的吸光值，31 為BIOLOG 生態(tài)板上碳源數(shù)量。

香農(nóng)-威納（Shannon-Wiener）多樣性指數(shù)（H）：式中，Pi為第i孔的相對吸光值與整個平板相對吸光值總和的比率。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

利用 Excel 2011 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用Origin 8.6 軟件作圖，采用SPSS 17.0 軟件對各指標進行方差分析，用多重比較法（LSD）進行差異顯著性檢驗，顯著水平設(shè)為0.05。使用CANOCO 4. 5. 1 軟件（Microcomputer Power，Ithaca，美國）對微生物功能多樣性與主要碳源利用類型進行冗余分析，采用 499 次的蒙特卡羅排列檢驗（MonteCarlo permutation test，499 permutations，reduced model）進行顯著性檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 不同有機物料添加下植煙土壤無機氮礦化量的變化

對于高有機質(zhì)植煙土壤，在整個培養(yǎng)過程中，添加油菜秸稈、菜籽餅和黑麥草處理下土壤硝態(tài)氮均呈現(xiàn)逐漸增加趨勢（圖1）。在培養(yǎng)前21 天，與對照相比，油菜秸稈、稻草和黑麥草處理均顯著降低了高有機質(zhì)土壤硝態(tài)氮含量，其中稻草處理降低了267.9%～675.9%；隨著培養(yǎng)時期延續(xù)，油菜秸稈和黑麥草處理土壤硝態(tài)氮含量與對照差異逐漸不明顯，而在整個培養(yǎng)階段稻草處理土壤硝態(tài)氮含量均顯著低于對照。但是，在整個培養(yǎng)時期菜籽餅處理增加了土壤硝態(tài)氮含量。而對低有機質(zhì)土壤，土壤硝態(tài)氮呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與對照相比，不同有機物料添加均顯著增加了土壤硝態(tài)氮含量。

在整個培養(yǎng)過程中，幾種有機物料處理下高有機質(zhì)土壤銨態(tài)氮含量呈逐漸下降趨勢，而低有機質(zhì)土壤呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。在培養(yǎng)第14 天，稻草和菜籽餅處理顯著增加了高有機質(zhì)土壤銨態(tài)氮含量，而其他不同時期各有機物料無顯著性影響；但對于低有機質(zhì)土壤，油菜秸稈和稻草秸稈添加顯著降低了土壤銨態(tài)氮含量，而菜籽餅處理顯著增加了土壤銨態(tài)氮含量，增幅達2.7 倍～3.3 倍。

2.2 不同有機物料添加下植煙土壤硝化速率及凈礦化速率動態(tài)

對于高有機質(zhì)土壤，除稻草處理外，其他各有機物料處理和對照的表觀硝化速率在整個培養(yǎng)時期中均呈現(xiàn)先增加后下降趨勢（圖2a））；而對于低有機質(zhì)土壤，添加有機物料處理硝化速率呈現(xiàn)先增加后迅速下降的趨勢，但對照土壤在整個培養(yǎng)過程中無明顯變化（圖2b））。與對照相比，添加C/N 較高的有機物料（稻草、油菜秸稈、黑麥草）顯著降低了高有機質(zhì)土壤表觀硝化速率，而C/N 較低的菜籽餅處理顯著增加了土壤表觀硝化速率（圖2a））。然而對于低有機質(zhì)土壤，各有機物料添加均能顯著增加土壤表觀硝化速率（圖2b））。

在整個培養(yǎng)時期中，油菜秸稈、菜籽餅和黑麥草處理土壤的凈礦化速率呈先增加后下降的趨勢，而在培養(yǎng)的前31 d 稻草處理下土壤凈礦化速率呈負值，之后逐漸增加為正值（圖2c））。與對照相比，油菜、稻草和黑麥草處理顯著降低了高有機質(zhì)土壤凈礦化速率，而菜籽餅處理提高了土壤凈礦化速率（圖2d））。

2.3 不同有機物料添加下土壤酶活性變化

添加不同有機物料顯著提升了高有機質(zhì)土壤脲酶和轉(zhuǎn)化酶活性（圖3a），圖3c））。稻草、油菜秸稈、菜籽餅和黑麥草處理下土壤脲酶活性分別較對照增加了100.1%、88.4%、32.5%和40.6%（圖3a）），土壤轉(zhuǎn)化酶活性分別增加了253.0%、57.2%、134.6%和127.5%（圖3c））。在低有機質(zhì)土壤，添加油菜秸稈和稻草可顯著提升土壤脲酶活性，而菜籽餅處理顯著降低了土壤脲酶活性（圖3b））。相對于高有機質(zhì)土壤，添加有機物料對低有機質(zhì)土壤轉(zhuǎn)化酶影響更明顯，稻草、油菜秸稈和黑麥草處理下土壤轉(zhuǎn)化酶活性分別為對照的27 倍、18 倍和34 倍（圖3d））。四種有機物料類型之間，添加稻草處理的土壤脲酶和轉(zhuǎn)化酶活性最高，添加菜籽餅處理最低。

2.4 不同有機物料添加下土壤微生物功能多樣性變化

不同有機物料添加顯著提升了植煙土壤微生物碳源代謝活性。在高有機質(zhì)植煙土壤中，添加稻草、油菜秸稈和黑麥草處理土壤微生物活性分別為對照的2.8 倍、3.2 倍和3.6 倍（圖4a）），低有機質(zhì)植煙土壤下分別為對照的20.6 倍、12.9 倍和7.1 倍（圖4b））。同樣，稻草、油菜秸稈和黑麥草處理下土壤微生物功能多樣性顯著高于對照土壤，而菜籽餅添加對土壤微生物功能多樣性無顯著影響（圖4c），圖4d））。

通過對土壤微生物功能活性與主要利用碳源類型進行冗余分析，探討不同有機物料對土壤微生物功能多樣性起主要作用的因子。結(jié)果顯示各有機物料處理下土壤微生物功能群落發(fā)生明顯變異，其中，油菜秸稈和黑麥草處理較好地聚合在一起，而菜籽餅處理與其他有機物料處理出現(xiàn)明顯分化。對于高有機質(zhì)植煙土壤，利用氨基酸類、胺類等碳源的微生物種群的增多是造成油菜秸稈和黑麥草處理下微生物功能群落變異的主要因素，而利用酸類、糖類的微生物種群與稻草處理下微生物功能群落變異最為相關(guān)（圖5a））。對于低有機質(zhì)植煙土壤，利用糖類和脂類的微生物種群的增多是造成油菜秸稈處理下微生物功能群落變異的主要因素，而利用醇類和酸類的微生物種群是造成稻草處理下微生物功能群落變異的主要因素（圖5b））。

3 討 論

3.1 有機物料對土壤氮素礦化的影響

有機物料的特性決定了其施入土壤后的礦化行為[13-14]。高有機質(zhì)含量土壤中添加高C/N 的物料，如稻草、油菜秸稈和黑麥草對土壤無機氮有固持作用，且這種效應(yīng)與有機物料的C/N 比呈正相關(guān)性，表明土壤中不同有機物料處理間有機氮礦化過程與礦質(zhì)氮的微生物同化過程的強弱取決于有機物料的C/N[15-16]。本研究中，稻草C/N 明顯高于其他有機物料，而該處理下土壤呈現(xiàn)出負凈礦化速率（圖2），其原因在于豐富的碳源誘導了土壤微生物大量增殖，導致礦質(zhì)氮的生物固持作用大于有機氮的礦化作用[17-18]；而低C/N 的菜籽餅添加顯著促進了土壤的凈礦化速率，引起培養(yǎng)過程中土壤無機氮濃度顯著高于對照。對于低有機質(zhì)土壤，添加高C/N 的稻草、油菜秸稈和黑麥草雖然顯著降低了土壤凈礦化速率（圖2），但提升了土壤硝態(tài)氮濃度（圖1），這與有機物料添加下土壤硝化作用顯著高于對照有關(guān)，進而導致了土壤銨態(tài)氮濃度顯著降低[19-21]。同時，土壤氮的礦化是一個復雜的過程，受溫度、水分、土壤pH 等多種因素的影響，因此，在等氮條件下不同有機物料添加量的差異引起土壤有機質(zhì)、pH 和物理性質(zhì)等其他理化性質(zhì)的變化，這是否對土壤氮素礦化產(chǎn)生影響需要進一步研究[16，22]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在高有機質(zhì)土壤上添加高C/N 的稻草可引起土壤凈礦化速率顯著降低（圖2）。然而，若烤煙種植在有機質(zhì)含量過低的土壤，煙葉小而薄，烤后煙葉化學成分不協(xié)調(diào)，吃味平淡。本研究中在低有機質(zhì)植煙土壤中添加菜籽餅可顯著提升土壤的凈礦化速率（圖2），引起土壤中銨態(tài)氮積累和硝態(tài)氮濃度增加（圖1）。由此可見，C/N 不同的有機物料添加下引起土壤完全不同的氮礦化特征：高有機質(zhì)土壤中通過添加高C/N 的稻草可明顯增加土壤礦質(zhì)氮的固持，而低有機質(zhì)土壤增施低C/N 的菜籽餅肥可有效補充土壤本身較低的礦化能力，進而提高土壤礦質(zhì)氮含量。這在煙草農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要的現(xiàn)實指導意義。

值得注意的是，有機物料添加后土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮濃度在高、低有機質(zhì)土壤中表現(xiàn)差異較大，其中，在高有機質(zhì)土壤中硝態(tài)氮濃度顯著高于銨態(tài)氮，而在低有機質(zhì)土壤中表現(xiàn)為銨態(tài)氮濃度顯著高于硝態(tài)氮（圖1）。這一差異說明高有機質(zhì)土壤可能含有更高的硝化細菌數(shù)量，進而提高了土壤硝化效果[23]。也有研究發(fā)現(xiàn)長期施用有機肥的土壤中硝化細菌的群落組成發(fā)生了顯著變化，硝化能力較強的種屬如Nitrosospiracluster 3 在高有機質(zhì)土壤中明顯增多[24]。因此，低有機質(zhì)土壤硝化能力較弱是導致銨態(tài)氮在土壤積累的重要原因。

3.2 有機物料對土壤微生物性質(zhì)的影響

有機物料可以為土壤微生物增加額外營養(yǎng)源和能源，進而調(diào)控土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和代謝功能[22]。然而，鑒于土壤微生物的響應(yīng)差異，不同物料（碳源）可能誘導土壤中喜好該類碳源的微生物生長，從而對微生物群落代謝特征產(chǎn)生影響[25-26]。本研究表明，不管是高有機質(zhì)還是低有機質(zhì)土壤，添加有機物料后土壤微生物活性和功能多樣性均顯著上升（圖4）。大量外源有機物料的加入增加了土壤微生物生長所需要的有效性碳源數(shù)量和種類，這種在能源供應(yīng)方面的巨大擾動，極大地刺激了土壤異養(yǎng)微生物的活動，這也解釋了有機物料添加下引起培養(yǎng)前期轉(zhuǎn)化酶活性顯著提升而后期無明顯影響的結(jié)果（圖3）。與此同時，對土壤微生物酶活性動態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，高C/N 的有機物料添加顯著提高了土壤脲酶的活性，而低C/N 的菜籽餅添加對土壤脲酶無顯著影響（圖3），這與不同有機物料的添加對土壤微生物功能活性影響的結(jié)果一致。Zhou 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，添加外源物對低有機質(zhì)土壤微生物群落多樣性的影響大于高有機質(zhì)土壤?？梢?，除所施用的有機物料種類的影響外，本底土壤有機質(zhì)等也是影響微生物群落功能變異的重要因素。進一步對土壤微生物功能群落的冗余分析結(jié)果表明，不同類型有機物料誘導了土壤不同微生物功能群落的變異，其中，高有機質(zhì)土壤中添加稻草誘導了利用醇類和酯類碳源的微生物類群增加，而油菜秸稈和黑麥草處理主要誘導了利用胺類碳源微生物類群增加（圖5）。但是，無論是高有機質(zhì)還是低有機質(zhì)土壤，菜籽餅處理下土壤微生物群落對各種碳源利用能力并未明顯增強（圖5），這也解釋了菜籽餅添加下高有機質(zhì)土壤礦質(zhì)氮含量無顯著變化，而低有機質(zhì)土壤較高的銨態(tài)氮濃度可能來自物料本身的分解，而不是來自土壤有機氮的礦化[15]。

4 結(jié) 論

有機物料對土壤氮礦化的影響因土壤有機質(zhì)含量不同而異。施入高C/N 的有機物料（如稻草）可有效控制高有機質(zhì)植煙土壤的礦化速率，顯著降低土壤凈礦化氮水平；而在低有機質(zhì)植煙土壤施用高C/N 的有機物料將會加重土壤礦質(zhì)氮素缺乏，施用菜籽餅肥可顯著提升低有機質(zhì)土壤中銨態(tài)氮水平，但這可能主要來自有機物料自身礦化。高C/N 的有機物料施入顯著促進了土壤微生物功能多樣性，引起土壤酶活性增高；但不同有機物料誘導了對碳源利用類型差異的微生物種群增多，造成土壤微生物功能群落發(fā)生變異。由此可見，在煙草生產(chǎn)實際中，應(yīng)當根據(jù)植煙土壤性質(zhì)的差異合理安排有機物料種類施入，充分發(fā)揮不同有機物料的效應(yīng)，實現(xiàn)植煙土壤的可持續(xù)利用。

致謝感謝南京師范大學程誼教授在實驗設(shè)計中的幫助和指導！