程思遠(yuǎn)，李 歡，梅慧玲，王炫清，劉馨秋，陳 暄，馬青平，黎星輝?

（1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所，南京 210095；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院休閑農(nóng)業(yè)研究所，南京 210095；3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家有機(jī)類肥料工程技術(shù)研究中心，南京 210095）

茶樹（Camellia sinensis（L.）O. Kuntze）是重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物，我國茶葉產(chǎn)量和種植面積均為世界第一[1]。有“生態(tài)系統(tǒng)工程師”之名的蚯蚓，其作為大型土壤動物，能通過破碎、取食、消化、分泌、排泄（蚯蚓糞）、掘穴等一系列生命活動改善土壤理化性質(zhì)、促進(jìn)有機(jī)質(zhì)積累、調(diào)節(jié)土壤中碳氮磷循環(huán)、促進(jìn)物質(zhì)循環(huán)和能量代謝，利用腸道內(nèi)的活性酶降解土壤有機(jī)物[2-4]。蚯蚓活動促進(jìn)黏砂粒黏結(jié)為團(tuán)聚體，顯著促進(jìn)土壤微團(tuán)聚體的形成，將土壤中有機(jī)殘體與礦物混合，增加團(tuán)聚體有機(jī)碳含量，對提高土壤肥力有重要作用[5]。然而，目前對蚯蚓風(fēng)化土壤礦物和礦物固持有機(jī)碳的機(jī)理還不清楚。土壤團(tuán)聚體的物理保護(hù)和礦物的化學(xué)保護(hù)是影響土壤有機(jī)碳穩(wěn)定的重要因素，但目前通常是將土壤團(tuán)聚體和礦物-有機(jī)復(fù)合體隔離開來研究。

同步輻射紅外顯微成像技術(shù)（SR-FTIR）具有快速、直接、精準(zhǔn)且光譜寬（10～10 000 cm-1）、亮度高、發(fā)散度小以及具備時間結(jié)構(gòu)等優(yōu)良特性，可原位檢測土壤團(tuán)聚體中礦物和有機(jī)官能團(tuán)，分析微米級局域樣品[6-8]，能夠從生物樣品紅外光譜中識別振動的分子成分[9]。本文采用SR-FTIR 顯微光譜技術(shù)研究土壤團(tuán)聚體中礦物-有機(jī)復(fù)合體的紅外成像規(guī)律和官能團(tuán)特征，相比于傳統(tǒng)的紅外光譜技術(shù)，使用SR-FTIR 技術(shù)可以使衍射限制在幾毫米，它具有超聲高分辨率，能提供一個準(zhǔn)確的信號，為試驗(yàn)結(jié)果提供了更高的精準(zhǔn)度[10]。

不同有機(jī)物料的添加可提升土壤有機(jī)質(zhì)含量。菜籽餅富含高蛋白和氨基酸；茶樹修剪物富含多種礦質(zhì)營養(yǎng)及特殊的生化物質(zhì)；生物質(zhì)炭含有60%以上的碳，具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和抗分解性[11]，是較好的土壤改良劑。近年來，將農(nóng)林廢棄物（如秸稈和果樹枝條）制成生物質(zhì)炭還田被認(rèn)為是土壤增肥的重要途徑[12]。我國每年茶樹修剪物數(shù)量可觀，本研究充分利用茶樹修剪物等資源，將茶樹修剪物制成的生物質(zhì)炭，對比茶園常用有機(jī)肥菜籽餅肥進(jìn)行試驗(yàn)，意圖探索茶樹修剪物對土壤培肥的意義。為探究蚯蚓與不同有機(jī)物料互作對土壤結(jié)構(gòu)的影響，本文結(jié)合蚯蚓活動和不同有機(jī)物料展開培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，通過測定土壤理化性質(zhì)和同步輻射紅外光譜（SR-FTIR），原位表征土壤團(tuán)聚體成像特征和有機(jī)碳的存在形式，揭示蚯蚓與有機(jī)物料對茶園土壤結(jié)構(gòu)的影響，為茶園土壤管理提供一些科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤：盆栽土壤取自江蘇省南京市玄武區(qū)中山陵茶園（118°50' E，32°03' N），2018 年茶園年平均氣溫為15.3 ℃，該茶園為溫帶季風(fēng)氣候，年均降雨量1 106.5 mm。根據(jù)茶園的地形與種植面積情況采用S 散點(diǎn)法確定5 個取樣點(diǎn)，采集茶樹行間0～20 cm 表層土壤，將各個采樣點(diǎn)的土壤混勻，攤開剔除雜物后，自然風(fēng)干，過2 mm 篩待用。

茶樹修剪物：茶樹修剪物采集于南京雅潤茶葉有限公司高淳茶葉基地，將茶園修剪枝條按照粗細(xì)大小長短順序整理后及時攤開曬干，碾磨過20 目篩子待用。

生物質(zhì)炭：將茶樹修剪物曬干剪碎（<5 cm），裝入1 m3的反應(yīng)爐設(shè)備中，密封后，由外部的電加熱器將內(nèi)部的茶樹修剪物以每分鐘升溫8.5 ℃至400 ℃左右，保持8～10 h，至反應(yīng)爐的通風(fēng)管中沒有明顯的濃煙排出為止[13]。

蚯蚓和菜籽餅：蚯蚓和菜籽餅購自于江蘇省句容市王軍蚯蚓專業(yè)養(yǎng)殖有限公司，蚯蚓品種為威廉環(huán)毛蚓（Pheretima guillelmi），屬上食下居型蚯蚓[14]。在實(shí)驗(yàn)開始前利用濾紙法排空蚯蚓腸道，清腸方法：將干凈的濾紙放置在燒杯的底部，再向燒杯里加少許蒸餾水，以剛好浸沒濾紙，然后將蚯蚓放置于濾紙上后用保鮮膜將燒杯封口，并用注射器針頭將上方的保鮮膜扎孔，然后將燒杯放入溫度為20 ℃，濕度為80%～85%的恒溫箱中黑暗中清腸24 h。

供試土壤和有機(jī)物料基本理化性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤和有機(jī)物料基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physical and chemical properties of the soil and organic material tested

1.2 試驗(yàn)方法

于2018 年5 月18 日采集中山陵茶園土壤模擬盆栽培養(yǎng)試驗(yàn)，設(shè)置5 個處理，分別為：1）不施肥處理（CK）；2）不施肥+蚯蚓（BE）；3）15 g 菜籽餅（盆栽土重量的0.5%）+蚯蚓（CE）；4）60 g 茶樹修剪物（盆栽土重量的2%）+蚯蚓（JE）；5）60 g生物質(zhì)炭（盆栽土重量的2%）+蚯蚓（TE）。每個處理重復(fù)5 次，每盆裝培養(yǎng)土3 kg。原始蚯蚓經(jīng)過清腸處理后每1 kg 土壤接種蚯蚓10 g±0.02 g（2條）。選取一年生長勢基本一致的無性系健壯茶苗“龍井長葉”用于試驗(yàn)，每盆栽植6 株，并根據(jù)茶苗的生長環(huán)境溫度、濕度和觀察茶苗長勢不定期用去離子水澆灌茶苗，使試驗(yàn)土壤含水率保持在田間持水量的85%左右。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

試驗(yàn)培養(yǎng)3 個月時采集土壤樣品進(jìn)行分析測試，6 個月時采集一次土壤樣品測定pH。土壤基本理化性質(zhì)采用常規(guī)方法[15]測定。pH 利用ORION 3STAR（Thermo 公司，美國）pH 計測定（土壤/水為1/2.5 的質(zhì)量體積比）；全碳、全氮采用vario MACRO cube 系列元素分析儀（Elementar 公司，德國）測定。有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法測定，有機(jī)質(zhì)（OM）含量依據(jù)“OM 含量=TC 含量×1.724”進(jìn)行換算[16-17]。同步輻射紅外顯微光譜技術(shù)（SR-FTIR）與樣品處理：采用國家蛋白質(zhì)科學(xué)研究設(shè)施中的BL01B 紅外線站設(shè)備進(jìn)行同步輻射光源（Synchrotron Radiation Facility，SSRF）顯微成像檢測土壤微團(tuán)聚體[18]。選取培養(yǎng)了3 個月的土壤顆粒為研究對象，用水包埋土壤樣品，并保持其完整性，在全封閉式快速冷凍切片機(jī)（徠卡，型號CM1950，德國）內(nèi)進(jìn)行-20 ℃低溫切片，厚度約為2 μm。切好的樣品平鋪放置在低輻射的Low-E 鏡片上，干燥后在國家上海蛋白質(zhì)科學(xué)研究設(shè)施五線六站BL01B 線站紅外顯微成像儀進(jìn)行觀察（圖1）。面掃設(shè)置參數(shù)：光譜范圍650～4 000 cm-1；光闌孔徑20 μm×20 μm；步長10 μm×10 μm；光譜分辨率4 cm-1；掃描次數(shù)64 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及分析采用 Excel 2010、SPSS19.0完成。

2 結(jié) 果

2.1 土壤酸堿度（pH）

培養(yǎng)3 個月和6 個月時，土壤pH 均值如圖2所示，CK 處理分別為6.57、6.44，BE 處理分別為6.59、5.97，CE 處理分別為6.15、5.75，JE 處理分別為6.43、6.16，TE 處理分別為6.69、6.34，5 個處理組中第3 月pH 均值均高于第6 月，表明即使在蚯蚓活動下，添加不同有機(jī)物料處理的土壤pH均呈下降趨勢；但添加茶樹修剪物和生物質(zhì)炭處理有緩解土壤酸化效果，但無顯著性差異。

2.2 土壤全碳、全氮及碳氮比

從各處理（CK、BE、CE、JE、TE）中選取3次重復(fù)測定土壤基本養(yǎng)分狀況，如表2 所示。相較于CK 處理，BE 處理的土壤全碳、有機(jī)質(zhì)含量有升高趨勢，表明蚯蚓活動可提高土壤肥力；與BE 處理相比，蚯蚓配施有機(jī)物料的 CE、JE、TE 處理均提高了土壤全碳、全氮和有機(jī)質(zhì)含量，TE 處理提高效果最明顯，說明生物質(zhì)炭與蚯蚓配施對土壤肥力提升效果最好。

表2 不同施肥處理與接種蚯蚓下盆栽土壤基本養(yǎng)分狀況Table 2 Basic nutrient status of the soil in the pot relative to treatment

2.3 土壤團(tuán)聚體的顯微成像規(guī)律

本試驗(yàn)各處理中土壤團(tuán)聚體的同步輻射紅外顯微成像如圖3 所示，土壤中官能團(tuán)的指定如下：黏土礦物（Clay-OH，3 620 cm-1），脂肪（-C-H，2 920 cm-1），蛋白質(zhì)（-NH，1 650 cm-1），多糖（-OH，1 080 cm-1）[19]。從同步輻射紅外顯微成像圖可以看出多糖、蛋白質(zhì)、脂肪和黏土礦物均呈高度異質(zhì)性分布，且黏土礦物與多糖的分布規(guī)律較為相似，蛋白質(zhì)與脂肪的分布規(guī)律相似，而黏土礦物與蛋白質(zhì)和脂肪的分布規(guī)律有較大的差異；其中CK、BE 和TE 組中的多糖、蛋白質(zhì)、脂肪和黏土礦物的分布形狀為團(tuán)狀，而CE 和JE 組中的黏土礦物與大分子有機(jī)物具有較高的分散性。

2.4 土壤有機(jī)碳的存在形式

利用紅外顯微光譜技術(shù)（SR-FTIR）定性研究不同施肥處理中土壤有機(jī)碳的存在形式，圖4 為各處理土壤團(tuán)聚體的紅外吸收光譜。從圖中可以看到當(dāng)樣品在 3 620 cm-1左右會出現(xiàn)強(qiáng)烈的醇羥基-OH伸縮震動，波數(shù)在2 880 cm-1左右處會出現(xiàn)不對稱脂肪族-C-H 伸展震動，波數(shù)在1 732 cm-1左右處會出現(xiàn)不飽和鍵C=C 震動、不飽和鍵C=O 震動以及蛋白質(zhì)-NH 伸縮震動，波數(shù)在1 150 cm-1左右處會出現(xiàn)C-O 拉伸彎曲、多糖-OH 伸縮震動。相比CK處理，其他處理的伸縮震動整體更強(qiáng)烈，說明蚯蚓配施有機(jī)物料可使大分子有機(jī)官能團(tuán)與礦物結(jié)合能力增強(qiáng)，提高土壤固存能力，從而增加土壤中有機(jī)質(zhì)含量，其中CE 和TE 組更強(qiáng)烈，表明蚯蚓配施菜籽餅肥和生物質(zhì)炭提高土壤肥力效果更好，有利于茶樹生長。

2.5 黏土礦物和大分子有機(jī)物的官能團(tuán)相關(guān)性

黏土礦物和大分子有機(jī)物的官能團(tuán)相關(guān)性越強(qiáng)，礦物固碳越多，土壤肥力越高。土壤團(tuán)聚體中黏土礦物和大分子有機(jī)官能團(tuán)的相關(guān)性分析如圖5所示，5 個處理中黏土礦物和有機(jī)官能團(tuán)的決定系數(shù)（R2）由小到大均依次為：黏土礦物-蛋白質(zhì)、黏土礦物-多糖、黏土礦物-脂肪。該結(jié)果表明，土壤團(tuán)聚體中的黏土礦物和大分子有機(jī)物親和性有所差異，其中黏土礦物-脂肪的親和性最高，黏土礦物-蛋白質(zhì)親和性最低，黏土礦物-多糖親和性次之，且這種親和性差異不受有機(jī)物料與蚯蚓互作的影響。

3 討 論

在土壤生態(tài)系統(tǒng)中蚯蚓是最典型的大型動物之一，蚯蚓活動對改善土壤理化性質(zhì)、促進(jìn)物質(zhì)循環(huán)和能量代謝有重大貢獻(xiàn)[20-22]。井大煒等[23]研究表明，有機(jī)肥與蚯蚓糞的施用能顯著改善土壤物理性狀，提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，增強(qiáng)植物根系活力。這與本試驗(yàn)紅外顯微光譜技術(shù)（SR-FTIR）定性分析土壤有機(jī)質(zhì)的結(jié)果一致，相較于CK，其他四組處理的碳官能團(tuán)伸縮震動更強(qiáng)烈，表明接種蚯蚓處理可提高黏土礦物對大分子有機(jī)官能團(tuán)結(jié)合能力，從而提高土壤肥力。本研究采用的樣品水包埋法結(jié)合低溫冷凍切片技術(shù)，與傳統(tǒng)有機(jī)包埋法相比，可防止有機(jī)包埋試劑如樹脂、石蠟，OCT 包埋液的影響，同時保證了土壤團(tuán)聚體樣品的完整性。

李萍萍等[24]研究表明，與不施肥處理相比，配施不同有機(jī)化肥可有效提高土壤養(yǎng)分含量，均不同程度提高了土壤有機(jī)質(zhì)含量。這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，試驗(yàn)中蚯蚓配施有機(jī)物料的土壤處理中有機(jī)質(zhì)和全碳含量均有所提高。茶樹生長的土壤pH 應(yīng)控制在4.5～6.0，最適宜種植茶樹的pH 在4.5～5.5，但就pH 值降低這一現(xiàn)象，Abe 等[25]發(fā)現(xiàn)大量種植茶樹可以加速土壤酸化，K. OH[26]和Wang[27]等研究表明種植茶樹時限越長土壤酸化越明顯。這說明本試驗(yàn)中土壤pH 下降的原因是蚯蚓活動和茶苗長時間種植的綜合作用。

生物質(zhì)炭因含有以可溶性狀態(tài)在土壤中存在的Ca、K、Mg 等元素，可提高土壤固碳能力，目前被認(rèn)為是土壤較好的改良劑，相比其他有機(jī)物料能更明顯改善土壤理化性質(zhì)。蚯蚓能促進(jìn)土壤微生物的活動和養(yǎng)分循環(huán)，蚯蚓糞與分泌物可以提高土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分狀況[28-29]。單武雄等[30]研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)施用菜籽餅肥可以有效提供更多的碳和氮源，使土壤微生物數(shù)量增加，提高土壤養(yǎng)分有效性。本試驗(yàn)不同施肥處理土壤紅外吸收光譜在CE 和TE 組中碳官能團(tuán)信號最強(qiáng)，表明蚯蚓配施菜籽餅肥和生物質(zhì)炭更有利于提高土壤肥力。蚯蚓活動可促進(jìn)土壤團(tuán)聚體的形成，改善土壤質(zhì)地，Lehmann 等[31]采用同步輻射紅外顯微成像方法研究土壤團(tuán)聚體時發(fā)現(xiàn)，土壤團(tuán)聚體的碳官能團(tuán)分布具有異質(zhì)性，Riedel 等[32]研究發(fā)現(xiàn)泥炭地中活性鐵可以優(yōu)先保護(hù)芳香族化合物，Mayer 和Xing[33]指出土壤團(tuán)聚體中礦物-有機(jī)復(fù)合體相互作用有利于保護(hù)有機(jī)質(zhì)及有機(jī)質(zhì)內(nèi)部聚合物，Tisdall 和Oades[34]發(fā)現(xiàn)黏土礦物和大分子有機(jī)物均有分散性，且微土壤團(tuán)聚體更穩(wěn)定。

大量研究表明因土施肥、化肥與有機(jī)肥配施可以緩急相濟(jì)，短長互補(bǔ)，充分發(fā)揮各自的增產(chǎn)潛力，可改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，延緩?fù)寥浪峄?，提高土壤保肥能力，在改土培肥方面有顯著作用。近年來，針對我國土壤有機(jī)質(zhì)含量嚴(yán)重下降的狀況，農(nóng)業(yè)部實(shí)施土壤有機(jī)質(zhì)提升行動，提高耕地土壤有機(jī)質(zhì)水平已經(jīng)成為國家層面的戰(zhàn)略決策。茶葉是我國重要經(jīng)濟(jì)作物，農(nóng)業(yè)部印發(fā)了茶園有機(jī)肥代替化肥技術(shù)方案，以求大力提升茶園土壤有機(jī)質(zhì)水平。提升土壤肥力的核心是增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，提升土壤有機(jī)質(zhì)穩(wěn)定性。為防止有機(jī)質(zhì)的流失，有必要關(guān)注有機(jī)質(zhì)的穩(wěn)定化過程。本文研究了5 個處理的盆栽土壤團(tuán)聚體的同步輻射紅外顯微成像特征和規(guī)律，為研究蚯蚓活動配施有機(jī)物料對茶園土壤結(jié)構(gòu)的影響提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

與不施肥處理相比，接種蚯蚓與有機(jī)物料配施處理提高了土壤全碳含量，提升黏土礦物對大分子有機(jī)官能團(tuán)的結(jié)合能力，其中蚯蚓配施菜籽餅肥和生物炭對提高土壤肥力效果明顯。即使在蚯蚓活動下，添加不同有機(jī)物料的各個處理中土壤pH 值均呈下降趨勢，但添加茶樹修剪物和生物炭可延緩?fù)寥浪峄俾?。同步輻射紅外顯微成像結(jié)果表明土壤團(tuán)聚體中多糖、蛋白質(zhì)、脂肪和黏土礦物均呈高度異質(zhì)性分布，其中黏土礦物與多糖的分布規(guī)律相似，蛋白質(zhì)與脂肪的分布規(guī)律相似，而黏土礦物與蛋白質(zhì)和脂肪的分布規(guī)律有較大的差異。土壤團(tuán)聚體中的黏土礦物和有機(jī)官能團(tuán)的決定系數(shù)（R2）由小到大均依次為：黏土礦物-蛋白質(zhì)、黏土礦物-多糖、黏土礦物-脂肪，親和性有差異且不受蚯蚓活動和施肥處理的影響，土壤團(tuán)聚體通過礦物-有機(jī)復(fù)合體將有機(jī)質(zhì)留存于土壤中，提高土壤有機(jī)質(zhì)含量。